парафиновые процедуры для рук и ног в домашних условиях, пошаговая инструкция для выполнения
Уход за рукамиКаждый человек хочет быть красивым и желанным, особенно это касается прекрасной половины человечества. Девушки и женщины заботятся не только о своем здоровье, но и внешней красоте. Для того чтобы выглядеть привлекательно, важно следить за всем, включая кожу рук и ног, о которых иногда просто забывают. Парафинотерапия является замечательным вариантом ухода и придания кожному покрову нежности и подтянутости, потому важно знать обо всех тонкостях процедуры и уметь ее проводить.
Что это такое?
Польза парафинотерапии известна уже достаточно давно и с успехом практикуется многими людьми, ведь эффект доказан на практике.
Использование парафина имеет механическое и тепловое влияние на покровы тела человека. Когда вещество начинает застывать, оно уменьшается в размерах примерно на 10%, приобретая эластичность и оказывая компрессионное действие на ткани. Такое влияние позволяет активнее проникать теплу внутрь покровов, что уменьшает просвет поверхностных сосудов, а это, в свою очередь, ускоряет кровоток вместе с лимфотоком.
Подобная процедура помогает избавиться от вредных веществ и токсинов, которые накапливаются в организме.
Благодаря воздействию тепла поверхность кожи немного нагревается, что дает возможность увеличить межклеточное пространство, раскрыть поры и размягчить ороговевший слой клеток.
Важно правильно проводить парафинотерапию, используя для этого медицинский белый очищенный состав, в котором нет никаких примесей. Чтобы сделать его жидким, нужно поместить вещество на водяную баню и довести до кипения. .
Если за раз не удалось использовать весь парафин, можно использовать его повторно, но важно стерилизовать перед повторным применением
Парафинотерапия положительно влияет на организм человека благодаря:
- процессу расширения стенок капилляров;
- усиленному процессу обмена веществ на участке, где проводится процедура;
- он помогает вывести продукты обмена с кожных покровов.
Кроме того, воздействие парафина дает такой эффект, как:
- мягкость, увлажнение кожных покровов;
- очистка пор;
- избавление от отечных процессов;
- лифтинг и подтяжка кожи;
- обеспечение питательными веществами ногтей;
- вывод продуктов обмена;
- быстрый процесс заживления и помощь в восстановлении поврежденных участков кожи;
- снижение воспалений и болей при хроническом состоянии.
Парафинотерапия рук – это распространенная процедура, которой пользуется множество женщин. Руки у женщин стареют быстрее всего, кожа приобретает сухость и внешний вид их уже в 30 далеко не тот, что был в молодости. Благодаря использованию парафина можно добиться смягчения кожных покровов, повышения их эластичности и небольшого лифтинг-эффекта. Если начать использовать средство сразу после появления первых признаков огрубения кожи, то можно исправить ситуацию и на долгие годы сохранить руки красивыми, а кожу молодой и упругой.
Можно также совершать ванны для ног, чтобы уменьшить количество ороговевших клеток, особенно в зоне пятки и большого пальца. Процедура эта приятная и имеет хорошие результаты использования, позволяя за несколько применений избавиться от огрубевших участков и предотвратить их появление снова.
Использовать парафин несложно, а польза от него довольно большая, потому стоит присмотреться к данному методу внимательнее, изучить все достоинства и недостатки и попробовать испытать ее чудодейственный эффект на себе.
Польза и вред
Парафинотерапия представляет собой косметическую процедуру по уходу за кожей, которая имеет отличные результаты.
Ввиду особенностей человеческого организма есть люди, которым нежелательно использовать ее по ряду причин:
- непереносимость компонентов состава;
- воспаления в острой форме;
- период обострения хронических заболеваний;
- наличие солнечных ожогов;
- онкология;
- гипертония;
- варикозное расширение вен;
- диабет;
- туберкулез;
- повреждения кожного покрова после проведения парафинотерапии;
- гнойники, высыпания, открытые раны или воспаления;
- экзема в острой стадии;
- наличие гипертрихоза у девушек;
- розацеа.
Если говорить о видовом разнообразии, то выделяют всего два варианта процедуры, который можно применить для ухода за руками – это холодный и горячий.
Холодный метод
При использовании холодного метода не нужно растапливать парафин, он уже имеет консистенцию крема, что дает возможность удобно нанести его на руки.
Чтобы помочь кожному покрову быстрее начать потеть, необходимо надеть на руки полиэтиленовые пакеты или перчатки. Важной особенностью крема-парафина является узкая специализация. Его нельзя наносить на лицо, потому как консистенция слишком тяжелая и есть риск забивания пор и возникновения аллергических реакций.
Горячий метод
При использовании горячего метода необходимо расплавить парафин на бане, а кожу обработать антисептиком. Лучше всего до использования парафина сделать пилинг, чтобы поры были полностью подготовлены к воздействию состава. В емкость, где был разогрет парафин, нужно несколько раз опустить руки, после чего одеть их в теплые перчатки, которые должны быть уже приготовлены. По прошествии получаса парафин удаляется, а руки увлажняются специальным кремом.
Горячую разновидность рекомендуют при наличии определенных заболеваний, а холодную чаще выбирают те, кто чувствителен к теплу или не желает тратить много времени и усилий на подготовку. Разница между этими методиками в том, что холодный парафин имеет комнатную температуру, а горячий значительно теплее, что способствует дополнительному нагреву кожного покрова. Структура холодного крем-парафина более плотная, чем у горячего, потому эффект получается более сильным и держится более длительный срок.
Холодная разновидность имеет консистенцию крема, тогда как горячий парафин – это жидкая субстанция, которая после остывания становится твердой пленкой.
Достоинством холодного варианта является наличие в нем большего количества полезных ингредиентов, чем в горячем. Так, в нем можно найти эфирное масло, лецитин, протеины с витаминами и не только. Холодный тип парафинотерапии рекомендуется практически всем, даже беременным, его легко использовать, а эффект можно получить практически сразу.
Правила выполнения
Процедура парафинотерапии рук в салоне отличается от тех методов, которые можно проделать дома. Разница состоит в принципах наложения состава. Это может быть:
- Наслоение. Парафин расплавляют при температуре в 60 градусов и наносят на поверхность кожи при помощи специализированной кисточки. Слой при этом получается от одного до двух миллиметров.
Когда нужная область обработана, ее накрывают полиэтиленом или вощеной бумагой. Завершающим этапом будет накрывание теплым полотенцем или одеялом. Нанесенный парафин имеет температурный показатель около 50 градусов и хорошо прогревает кожу.
- Использование ванн. Кисти рук изначально обрабатываются кисточкой с парафином, который должен иметь температуру около 50 градусов, после этого руку следует обернуть в полиэтилен или погрузить в ванну, где будет находиться парафин в жидком состоянии, так как его температура будет более 60 градусов.
- Аппликации при помощи салфетки. На них наносится парафин толстым слоем в два захода, пока общая толщина не достигнет полсантиметра. Следующий шаг – это накладка повязки из марли, которую нужно сложить не менее чем из 10-ти слоев, смоченных в растворе парафина с температурой 70 градусов.
Последним этапом будет оборачивание полиэтиленом и укрывание рук теплым одеялом.
- Аппликация кюветой. Процедура, которая предполагает разливание парафина в жидком состоянии по пятисантиметровым кюветам высотой не более 2 см. В них заранее должна быть размещена пленка, по размеру значительно превосходящая формочку. Ее размер должен быть таким, как участок, на котором будет происходить аппликация. Как только парафин остынет и будет мягким, его на пленке накладывают на нужную часть руки. Последним шагом будет укрывание обрабатываемого участка одеялом.
- Использование парафино-масляной смеси, для которой используют парафин, рыбий жир или же хлопковое масло. Эти компоненты соединяют и доводят до температуры в сто градусов, после чего вливают в пульверизатор и таким образом наносят на поверхность кожи рук. В процессе распыления состав теряет до 30 градусов тепла, не обжигая при этом кожу. Когда вся поверхность обработана, образовавшийся слой накрывают при помощи салфетки.
Она должна быть стерильной и предварительно смоченной в той же смеси.
Работа в салоне имеет четкую последовательность действий, которую нельзя нарушать:
- дезинфекция рук перед началом процедуры;
- нанесение питательного крема, который имеет увлажняющее действие;
- погружение рук в ванну с парафином на 2-3 секунды, потом они вынимаются на такое же время и снова погружаются;
- надевание на них полиэтиленовых перчаток;
- поверх перчаток надеваются махровые специализированные варежки;
- процедура проходит около 20-ти минут;
- по истечении времени нужно снять варежки и перчатки, убрать воск и хорошо вытереть руки.
После окончания процедуры желательно минут 30 еще провести в салоне, чтобы руки остыли до температуры окружающей среды и не возникло дискомфорта от резкой смены окружающей обстановки.
![]()
Как сделать в домашних условиях?
Проведение парафинотерапии – не слишком сложный процесс, и провести его можно просто у себя дома. Эффект от процедуры достаточно быстрый, уже после первого использования можно заметить явные изменения в лучшую сторону. При систематическом использовании парафина можно кардинально преобразить внешний вид своих рук, омолодив их на несколько лет.
Чтобы провести процедуру дома, нужно иметь:
- Медицинский парафин. Нельзя для косметических мероприятий брать свечи и растапливать их, потому как это может негативно сказаться на здоровье кожи, а то и вовсе вызвать ожог. Приобрести специализированный парафин можно в магазинах, где продают косметику, в аптеках и в крупных супермаркетах.
- Перчатки из полиэтилена.
- Варежки из махрового полотенца, которые можно купить или самостоятельно сшить.
Если нет такой возможности, то подойдет и простое теплое полотенце.
- Если есть желание проводить парафинотерапию рук довольно часто, то можно приобрести целый набор, в который входит сам воск, перчатки, ванна с функцией подогрева, где будет происходить растапливание парафина. Если данный вариант процедур будет проводиться редко или за неимением ванны, для растопления ингредиентов можно воспользоваться обычной небольшой кастрюлей. Удобно, что после использования будет совсем несложно ее вымыть.
Для того чтобы сделать парафинотерапию рук правильно, важно совершать все действия в правильной последовательности.
Пошаговая инструкция будет выглядеть таким образом:
- Первым делом стоит позаботиться о ногтях. Этот процесс должен быть сделан до проведения работ с использованием парафина. Руки нужно окунуть в емкость с теплой водой, в которую добавлена сода. Работа начинается с кутикул, которые отодвигаются, после чего убирается лишняя их часть, а уже потом нужно перейти к самой обрезке ногтя.
Независимо от того, будет ли проводиться покрытие ногтей гелем или лаком, все процедуры по уходу проводят именно перед парафинотерапией.
- Как только работа с ногтями завершена, можно делать саму процедуру, для чего необходимо расплавить парафин. Наличие специализированной ванночки облегчает задачу, но можно справиться и при помощи подручных средств, используя паровую баню. Процесс подогрева не стоит затягивать, иначе температура полученной массы будет очень высокая. В тот момент, когда состав начнет расплавляться, можно убирать его с плиты. Парафин плавится при температуре 70 градусов, воду до кипения доводить не нужно.
- Если есть желание сделать массу более питательной и добавить эфирные масла и прочие добавки, то этот процесс нужно производить одновременно с растопкой, чтобы все компоненты хорошо перемешались. Если вносить добавочные вещества после снятия парафина с огня, они могут расслаиваться и не распределиться по всей поверхности рук, а значит, не принесут ожидаемой от них пользы.
- Емкость, которую необходимо будет использовать под ванну, нужно подбирать подходящих размеров, чтобы в нее можно было без проблем окунуть одну или сразу две кисти рук. Количество погружений должно быть не менее двух, а то и трех для каждой руки. Чем больше будет слоев парафина, тем лучшим будет эффект благодаря более длительной возможности удерживать тепло.
- Перчатки из полиэтилена подготавливаются заранее и помещаются рядом с местом проведения процедуры. Важно их изначально раскрыть, чтобы после ванн сразу опустить в них кисти рук. Как только перчатки будут надеты, нужно сразу же надеть теплые махровые варежки или закутать руки в полотенце или одеяло.
- Как только масса затвердеет, можно снимать все с рук. Парафин легко отходит от кожи, не оставляя на ней никаких следов.
На посуде, где проводились приготовления, остатки лучше всего удалять после того, как состав полностью высохнет, так будет проще его счистить. В случае использования добавок лучше помыть емкость с мылом.
Процесс парафинотерапии для кожи рук можно проводить в любое время и в любом количестве. Рекомендуется использовать данное средство не более двух раз за неделю на протяжении двух месяцев. Эффект будет виден от каждого применения парафина, потому не нужно ждать какое-то время, чтобы увидеть результат, кожа рук станет намного мягче, эластичнее и приятнее уже с первого использования. Преимущество данного процесса в том, что тратя на него не более 40 минут, можно получить эффект омоложения, избавиться от неприятных ощущений сухости кожи рук, не затрачивая больших денежных ресурсов и не покидая собственный дом.
Полезные советы
Как рекомендуют девушки в отзывах, приобретая парафин, лучше всего выбирать варианты, в которых уже есть добавки. Это может быть масло персика, которое хорошо подходит людям с аллергией, масло карите, которое отлично помогает бороться с возрастными изменениями кожи, экстракт чайной розы, имеющий в своем составе витамин Е и масло шиповника, без которых не проводят СПА-процедур.
Использование горячего варианта парафинотерапии рук должно быть осознанным и выполняться в соответствии с инструкцией. Важно не перегревать состав, иначе есть риск получить ожог кожи. Для того чтобы проверить температуру, нужно нанести немного средства на тыльную сторону ладони, и если не будет неприятных ощущений, значит, можно проводить процедуру. Важно приобретать качественный продукт, ведь от этого зависит здоровье рук. Частично показателем качества может служить цена. Слишком дешевые варианты вряд ли будут хорошими, потому стоит выбирать продукт в средней ценовой категории.
В том случае, если процедура с использованием парафина будут проводиться часто, лучше единоразово потратиться и приобрести специальную ванну, что ускорит процесс, она будет нагревать состав именно до нужной температуры, поэтому отпадет необходимость в постоянном поиске подходящей емкости. Выбирая такой аппарат, следует сразу определиться, для каких частей тела он будет нужен, от этого будут зависеть его габариты.
Если нужна емкость будет только для рук, то достаточно 2 литров, для ног потребуется больший объем.
Выбирая ванну, стоит обратить внимание и на скорость разогрева парафина. Чем она выше, тем лучше. Хорошим дополнением будет терморегулятор. Особенно приятной функцией будет наличие фильтра, который помогает в процессе очищения самого парафина и облегчает уборку емкости. Оптимальным вариантом будет наличие нескользящего покрытия на дне ванны или наличие присосок, которые гарантируют устойчивость емкости и повышают комфорт от ее использования.
Если процедура парафинотерапии будет проводиться впервые, желательно провериться на наличие аллергии на тот или иной компонент или добавку, чтобы не навредить себе. Можно сделать это в медучреждении или опытным путем, приготовив раствор и окунув в него палец. После того как пройдут сутки, можно делать вывод – если нет покраснений, зуда, сыпи и прочих признаков аллергии, значит, можно смело начинать процедуру. Имея любые отклонения от нормального состояния, для которого разрешено применение маски из парафина, не нужно его использовать, потому как это принесет только вред.
Более подробно о процедуре парафинотерапии расскажет следующее видео.
US $ 1.28-1.38 / сумка (FOB Price)
1000 Сумки (мин
800-1100 долл. США / Метрическая тонна (Цена FOB)
1 Метрическая тонна (мин.Заказать
US $ 1071.0-1086.0 / TON .0 / TON (FOB Price) (FOB)
1 тонн (мин. Заказать)
US $ 800-1100/ METRIC TON
(FOB Price)1 Метрическая тонка (мин. Заказать)
US $ 550-600/ Метрическая TON / (FOB Price)
25 Метрические тонны
(мин. Заказать)US $ 1200.0-1200,0 / килограммов Цена FOB)
1000 кг (мин.Заказать
US $ 800-1100 / Метрическая TON / (FOB Price)
1 Метрическая Тонна (мин. Заказать)
US $ 800-1100 / Метрическая TON (FOB Price)
1 Метрическая TON (мин. Заказать)
US $ 1071.0-1086.0 / TON (FOB Price)
(мин. Заказать)US $ 800-1100 / Метрическая тонна 9000/ (Цена FOB)
1 метрическая тонна (мин.Заказать
US $ 800-1100 / Метрическая тонна / (FOB Price)
1 Метрическая Тонна (мин. Заказать)
US $ 1071.0-1086.0 / TON (FOB Price)
1 тонн (мин. Заказать)
US $ 100.0-150.0 / грамм (FOB Price)
200 грамм
(мин. Заказать)US $ 15.9-22.9 / Box (FOB Price )
1 коробка (мин.Заказать
US $ 1.3-1,3 / килограммов (FOB Price)
200 килограммов (мин. Заказать)
US $ 0.1-0.2 / Box (FOB Price)
5000 коробок (мин. Заказать)
US $ 20-40/ килограмм (FOB Price)
1 килограмм (мин. Заказать)
US $ 0.35-0.45 / Pack
50000 упаковок (мин.Заказать
US $ 1.45-1.89 / Piece (FOB Price)
1 шт. (мин. Заказать)
US $ 20-40 / килограмм (FOB Price)
1 килограмм (мин. Заказать)
US $ 16.4-17.4 / Шт. (FOB Price)
300 штук (мин. Заказать)
US $ 0.6-0,7 / piece (FOB Price)
500 штук (мин.Заказать
US $ 0.55-1.0 / Prie (FOB Price)
100 пар (мин. Заказать)
US $ 4.43-5.17 / Коробки (FOB Price)
12 ящиков (мин. Заказать)
US $ 0. 16-0.2 / Prie (FOB Price)
50000 пар (мин. Заказать)
US $ 2.8-3.0 / коробки (FOB Price)
1000 коробок (мин.Заказать
US $ 3-5 / килограмм (FOB Price)
25 килограммов (мин. Заказать)
US $ 1.99-199 / Сумки (FOB Price)
2000 Сумки (мин. Заказать)
US $ 1-10 / килограмм (цена FOB)
1 килограмм (мин. Заказать)
US $ 1-2 / килограмма (FOB Price)
1000 кг (мин.Заказать
US $ 9.85-10.62 / Piece (FOB Price)
1 шт. (мин. Заказать)
US $ 1-59 / Piece (FOB Price)
1 шт. (мин. Заказать)
US $ 0.5-0.8 / Piece (FOB Price)
10 шт. (мин. Заказать)
US $ 0.49-0.75 / Пара (FOB Price)
1000 пар (мин. Заказать
US $ 0.02-0.04 / Piece (FOB Price)
12000 штук (мин. Заказать)
(мин. Заказать)US $ 0.49-0.98 / Пара (FOB Price)
100 пар (Минимальный заказ)
{{#if ценаОт}}{{priceCurrencyType}} {{priceFrom}} {{#если цена до}} — {{цена}} {{/если}} {{#if priceUnit}} / {{priceUnit}} {{/если}}
{{/если}} {{#if minOrderQuantity}}{{minOrderQuantity}} {{#if minOrderType}} {{minOrderType}} {{/если}}
{{/если}}Парафиновая ванна Homedics PAR-70 Para Spa Plus Руководство по эксплуатации и информация о гарантии
Ограниченная гарантия на 1 год
Наслаждайтесь теплом, успокаивающим эффектом снятия мышечного напряжения и увлажнением сухих рук.
Благодарим вас за приобретение освежающей парафиновой ванны HoMedics ParaSpaPlus для дома. Это, как и вся линейка HoMedics, изготовлено с высоким мастерством.
Мы надеемся, что вы найдете его лучшим продуктом в своем роде.
Парафиновая ванна ParaSpaPlus превращает ваш дом в салон, предоставляя вам непревзойденные ощущения, помогая расслабиться, снять напряжение и успокоить боль в мышцах.
Расслабься. Продлить. Упрощать.
ВАЖНЫЕ МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ИЗДЕЛИЙ, ОСОБЕННО В ПРИСУТСТВИИ ДЕтей, СЛЕДУЕТ ВСЕГДА СОБЛЮДАТЬ ОСНОВНЫЕ МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ, В ТОМ ЧИСЛЕ:
ПРОЧИТАЙТЕ ВСЕ ИНСТРУКЦИИ ПЕРЕД ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ.
ОПАСНОСТЬ — ДЛЯ СНИЖЕНИЯ РИСК ПОРАЖЕНИЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ТОКОМ:
- Не тяните за прибор, упавший в воду. Немедленно отключите его.
- Не размещайте прибор там, где он может упасть или попасть в ванну или раковину. Не кладите и не бросайте в воду или другую жидкость. Хранить в прохладном сухом месте.
- Всегда отключайте прибор от электрической розетки перед очисткой.
- Не подключайте и не отключайте это изделие мокрыми руками.
- Не используйте во время купания.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ – ДЛЯ СНИЖЕНИЯ РИСКА ОЖОГОВ, ПОРАЖЕНИЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКИМ ТОКОМ, ПОЖАРА ИЛИ ТРАВМ ЛЮДЕЙ: - При использовании данного прибора детьми, инвалидами или лицами с ограниченными возможностями, на них или рядом с ними необходим тщательный надзор.
- Этот продукт никогда не должен использоваться лицами, страдающими каким-либо физическим заболеванием, которое может ограничить возможности пользователя по работе с элементами управления.
- Используйте этот прибор только по назначению, как описано в данном руководстве.
- Не используйте насадки, не рекомендованные HoMedics, в частности любые насадки, не поставляемые с устройством.
- Не используйте этот прибор, если у него поврежден шнур или вилка, если он не работает должным образом, если его уронили, повредили или уронили в воду. Верните его в сервисный центр HoMedics для осмотра и ремонта.
- Держите шнур подальше от нагретых поверхностей.
- Не роняйте и не вставляйте никакие предметы в отверстия.
- Не переносите этот прибор за шнур питания и не используйте шнур в качестве ручки.
- Не использовать на открытом воздухе.
- Не допускайте свисания шнура с края стола или прилавка, где дети могут за него потянуть или случайно споткнуться.
- Не размещайте на горячих газах, пламени, электрических элементах или в нагретой духовке или рядом с ними.
- Не работайте там, где используются аэрозольные распылители или где подается кислород.
- Никогда не используйте этот продукт во время сна или сонливости.
- Никогда не используйте острые инструменты для удаления затвердевшего парафина из устройства.
- Используйте прибор только на прочной ровной поверхности.
Это устройство предназначено только для домашнего использования. Данное устройство не предназначено для коммерческого использования.Это устройство не является профессиональным устройством.
СОХРАНИТЕ НАСТОЯЩИЕ ИНСТРУКЦИИ
Предупреждение: Перед началом работы внимательно прочтите все инструкции.
ОСОБЫЕ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ:
ЕСЛИ У ВАС ЕСТЬ ИЛИ БЫЛИ КАКИЕ-ЛИБО ЗАБОЛЕВАНИЯ КОЖИ, ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЛИ ПРОБЛЕМЫ СО ЗДОРОВЬЕМ, ВЫ ДОЛЖНЫ ПРОКОНСУЛЬТИРОВАТЬСЯ С ВРАЧОМ ПЕРЕД ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ.
- Не наносите парафин на открытые порезы или раны, бородавки, воспаленную кожу или при снижении чувствительности в конечностях.
- Перед использованием проконсультируйтесь с врачом, если у вас есть какие-либо вопросы или опасения по поводу острого воспаления и заболевания периферических сосудов или снижения чувствительности любой конечности.
- Не наносите горячий воск на глаза или другие чувствительные к теплу участки.
- Прекратите использование и обратитесь к врачу, если парафин слишком горячий или недостаточно теплый. Это может указывать на возможную физическую проблему.
- Прекратите использование и обратитесь к врачу, если дерматит, дискомфорт, раздражение или боль возникают в результате продолжительного лечения парафином.
- Проверьте парафин на внутренней стороне запястья, чтобы убедиться, что температура удобна.
- Не переполняйте устройство и всегда держите парафин на уровне примерно 1,5 дюйма от верха ванны.
- Никогда не используйте устройство без парафина.
- Не нагревайте парафин в пластиковой упаковке, не нагревайте его над открытым огнем, на плите, плите или в микроволновой печи.
- Не выливайте расплавленный парафин из бака/устройства.
- Отключите устройство от сети перед заполнением парафином.
- Не используйте аксессуары или воск, не рекомендованные или не проданные HoMedics.
- Если шнур питания поврежден, весь блок должен быть заменен в сервисном центре HoMedics.
- Не наливайте воду в бак/блок.
Предупреждение:
Этот прибор оснащен поляризованной вилкой ( один штекер шире другого). Чтобы снизить риск поражения электрическим током, вилка предназначена для подключения к поляризованной розетке только одним способом. Если вилка не полностью входит в розетку, переверните вилку. Если он по-прежнему не подходит, обратитесь к квалифицированному электрику.
Терапевтические преимущества
- Парафиновая тепловая терапия запечатывает тепло и контурирует пораженную область для окончательного влажного теплового лечения.
- Полезно для симптоматического облегчения боли, вызванной артритом, бурситом и хроническим воспалением суставов.
- Расслабляет мышцы, снимает скованность и мышечные спазмы.
- Стимулирует кровообращение.
- Смягчает и успокаивает сухую, потрескавшуюся кожу.
Важное примечание:
Это устройство может показаться очень теплым для чувствительной кожи.Однако, чтобы в полной мере ощутить терапевтические преимущества парафиновой термотерапии, воск необходимо нагреть до температуры 123–131 градус по Фаренгейту. Это температура, используемая в парафиновых ваннах ведущих больничных брендов.
Для правильного нанесения быстро окуните руку в расплавленный парафин и сразу же выньте ее. Это следует повторить 6-10 раз. Никогда не погружайте в воск более чем на 1-2 секунды. Если вы очень чувствительны к теплу или считаете, что этот прибор может быть не для вас, пожалуйста, верните этот продукт по месту покупки, перед использованием.
Как настроить установку ParaSpaPlus
- Извлеките все содержимое из упаковки и проверьте наличие всех следующих компонентов (см. рис. 1) парафиновой ванны ParaSpa:
• Парафиновая ванна
• 2 фунтов парафинового воска
• 20 пластиковых вкладышей - Поместите устройство на ровный и прочный стол или поверхность и поднимите крышку.
- Убедитесь, что ванна Para Spa пуста и чиста, прежде чем наливать в нее воск.
- Откройте пакеты с парафином и поместите воск в ванну.Устройство рассчитано на вес до 2,5 кг. парафина и минимум 2 фунта. Всегда держите уровень парафина заполненным до уровня «MIN», отмеченного на внутренней стороне ванны, но не выше линии «MAX».
- Подключите устройство к бытовой розетке 110/120 В переменного тока.
- Переместите синюю кнопку в положение «ВКЛ.». Большая овальная кнопка загорится красным. Красный свет указывает на то, что цикл плавления начался и еще не готов к использованию. См. рис. 2. (Приблизительное время плавления 2 часа).
- Цвет овальной кнопки изменится с красного на зеленый, когда воск будет готов к использованию. Нажмите на овальную кнопку, чтобы открыть крышку. Никогда не опускайте руку в воск, пока цвет кнопки не изменится с красного на зеленый.
- Переместите синюю кнопку в положение «ВЫКЛ», когда закончите пользоваться устройством.
ПРИМЕЧАНИЕ: НИКОГДА не погружайте руки в ванну ParaSpa, пока светодиодный индикатор горит красным. Это режим плавления и будет слишком жарко .
Как использовать парафиновую обработку
1. Прежде чем погрузить руку, проверьте парафин на внутренней стороне запястья, чтобы убедиться, что температура воска комфортна. Перед погружением снимите все украшения (например, кольца, браслеты, часы).
ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется вымыть обрабатываемую область и нанести на нее лосьон для рук на основе ланолина, прежде чем погрузить ее в парафин. Это облегчит удаление воска и поможет увлажнить кожу.
2. Окуните руку в расплавленный парафин и немедленно выньте ее. Подождите несколько секунд, пока воск не затвердеет. Старайтесь не двигать рукой во время нанесения воска. ПРИМЕЧАНИЕ. Процесс погружения быстрый.Не оставляйте руки в ванне. Не замачивать. Окунуться быстро в и из.
3. Повторите этот шаг несколько раз, пока не сформируется несколько слоев, рекомендуется 6-10 покрытий.
4. Для более длительной термообработки поместите пластиковый вкладыш (входит в комплект) на обрабатываемую область и закрутите пакет у отверстия. Держите парафин и прокладку на обработанной области в течение 15-30 минут для окончательной терапии. (См. рис. 3)
5. Снимите воск с обработанного участка. Если вы используете пластиковую подкладку, снимите пластиковую подкладку с обрабатываемой области. Парафин будет отслаиваться вместе с вкладышем. (См. рис. 4)
6. Утилизируйте использованный воск. Если вы единственный, кто использует ParaSpa, воск можно использовать повторно. Просто поместите его обратно в ванну, чтобы он снова растаял.
Техническое обслуживание
Периодически следует заменять использованную порцию парафина и чистить устройство.
- Отключите прибор от сети, дайте парафину застыть в течение ночи.
- Нажмите на один конец парафинового блока. Это поднимет настроение.Поднимите блок из блока и утилизируйте его. НЕ ИСПОЛЬЗУЙТЕ ОСТРЫЕ ПРЕДМЕТЫ ДЛЯ СНЯТИЯ БЛОКА ПАРАФИНА, ЭТО МОЖЕТ ПОКРАСИТЬ ИЛИ ПОВРЕДИТЬ ВАННУ. Если парафиновый воск не удаляется легко, подключите устройство к сети и дайте ему нагреться в течение 10–15 минут, затем снимите парафиновый блок и отключите устройство от сети.
- Протрите устройство внутри одноразовым полотенцем, чтобы удалить остатки грязи и парафина.
- Протрите влажной мыльной тканью. НЕ НАЛИВАЙТЕ ВОДУ В УСТРОЙСТВО И НЕ ПОГРУЖАЙТЕ УСТРОЙСТВО В ВОДУ.
- Хранить в прохладном, сухом месте. Когда вы будете готовы повторно использовать ванну ParaSpa для следующей термообработки, повторите шаги 2-7, «Как настроить установку ParaSpaPlus». Затем выполните шаги 1-6, «Как использовать парафинотерапию».
ОГРАНИЧЕННАЯ ГАРАНТИЯ НА ОДИН ГОД
(Действительна только в США)
HoMedics, Inc. гарантирует отсутствие дефектов материалов и изготовления в течение одного года с даты первоначальной покупки, за исключением отмеченных ниже.
Данная гарантия на продукцию HoMedics не распространяется на повреждения, вызванные неправильным использованием или злоупотреблением; авария; прикрепление любого неразрешенного аксессуара; изменение продукта; или любые другие условия, которые находятся вне контроля HoMedics. Настоящая гарантия действительна только в том случае, если изделие приобретено и эксплуатируется в США. Гарантия не распространяется на изделие, требующее модификации или адаптации для работы в любой стране, кроме страны, для которой оно было разработано, изготовлено, одобрено и/или разрешено, или ремонта изделий, поврежденных в результате этих модификаций.HoMedics не несет ответственности ни за какой случайный, косвенный или особый ущерб. Все подразумеваемые гарантии, включая, помимо прочего, подразумеваемые гарантии пригодности и товарного состояния, ограничены общей продолжительностью в один год с даты первоначальной покупки.
Чтобы получить гарантийное обслуживание продукта HoMedics, доставьте его лично или отправьте по почте с датой продажи (как доказательство покупки) с оплатой по факту вместе с чеком или денежным переводом на сумму 5 долларов США.00, подлежащих уплате HoMedics, Inc. для покрытия расходов на обработку.
После получения HoMedics отремонтирует или заменит ваш продукт и вернет его вам с постоплатой. Если целесообразно заменить ваш продукт, HoMedics заменит его таким же продуктом или сопоставимым продуктом по выбору HoMedics. Гарантия предоставляется исключительно сервисным центром HoMedics. Обслуживание этого продукта кем-либо, кроме сервисного центра HoMedics, аннулирует гарантию.
Настоящая гарантия предоставляет вам определенные юридические права.У вас могут быть дополнительные права, которые могут различаться в зависимости от штата. В соответствии с законодательством отдельных штатов некоторые из указанных выше ограничений и исключений могут на вас не распространяться.
Для получения дополнительной информации о линейке нашей продукции в трех странах США посетите: www.homedics.com
Электронная почта: HoMedics Service Center Dept. 168 3000 Pontiac Trail Commerce Township, MI 48390
Электронная почта: [email protected]
©2002 HoMedics, Inc. и ее дочерние компании, все права защищены. HoMedics® является зарегистрированным товарным знаком HoMedics Inc.и ее аффилированные компании. para Spa™ и Body Basics™ являются товарными знаками HoMedics Inc. и ее дочерних компаний.
Все права защищены.
IBPAR70-A
Объем рынка парафинового воска к 2028 г. достигнет 7,80 млрд долл. США; Растущий спрос со стороны косметической промышленности для стимулирования прогресса на рынке: Brainy Insights
НЬЮАРК, Н.J., 28 февраля 2022 г. /PRNewswire/ — Согласно отчету, опубликованному Brainy Insights, ожидается, что мировой рынок парафинового воска вырастет с 4,91 млрд долларов США в 2020 году до 7,80 млрд долларов США к 2028 году при среднегодовом темпе роста 5,82. % в прогнозный период 2021-2028 гг.
За последние несколько лет на рынке парафинового воска наблюдается устойчивый рост. Спрос на парафин для изготовления свечей очень высок из-за растущей популярности ароматерапии и парфюмерии для дома. Эти воски также можно использовать для облегчения боли в мышцах и суставах.Кроме того, парафиновый воск с высокой температурой плавления можно использовать в качестве внешней смазки для ПВХ. Высокие температуры плавления помогают добиться однородности и повысить скорость производства и текучесть продукта. В настоящее время парафиновый воск обычно используется для изготовления водонепроницаемого брезента благодаря его преимуществам, таким как долговечность, гидроизоляция и экономичность, и широко используется либо для защиты, либо для покрытия сельскохозяйственных культур и транспортных средств.
Получить образец отчета в формате PDF по телефону https://www.thebrainyinsights.com/enquiry/sample-request/12514
Парафиновый воск представляет собой бесцветный белый мягкий воск, который обычно бывает в твердой или жидкой форме. Его получают из нефтяного угля и горючих сланцев, состоящих из смеси твердых прямоцепочечных углеводородов. Он используется в бумаге, свечах, косметике, полиролях и электрических изоляторах. Он также помогает извлекать ароматы из цветов, обеспечивает водонепроницаемое покрытие для дерева и служит основой для медицинских мазей.
Мировой рынок парафинового воска растет устойчивыми темпами из-за увеличения спроса на различные виды конечного применения, такие как производство свечей, каучука, косметики и т. д. В дополнение к этому, растущее использование парафинового воска в упаковочная и автомобильная промышленность способствуют дальнейшему росту рынка. Кроме того, ожидается, что все более широкое применение парафинового воска для терапевтического лечения откроет новые возможности роста для поставщиков на рынке. Однако ожидается, что растущее использование экологически чистых альтернатив, таких как пчелиный воск, соя и полиэтиленовый воск, будет препятствовать росту рынка парафинового воска в течение прогнозируемого периода.
По любым вопросам, связанным с отчетом, обращайтесь к аналитику по адресу https://www.thebrainyinsights.com/enquiry/speak-to-analyst/12514
.Ключевые игроки, работающие на мировом рынке парафинового воска ExxonMobil, PetroChina Company Limited, Sasol, Honeywell, The International Group, Inc., Chennai Petroleum Corporation Limited (CPCL), Petrobras, Nippon Seiro Co., Ltd., Petro-Canada, Repsol , H&R Group, CEPSA и Indian Oil Corp Ltd (IOCL) среди прочих. Ключевые игроки в настоящее время концентрируются на реализации таких стратегий, как внедрение новых технологий, инновационных продуктов, слияний и поглощений, совместных предприятий, альянсов и партнерств, чтобы улучшить свои рыночные позиции в мировой индустрии парафина.
- В феврале 2018 года компания Sasol объявила об успешном вводе в эксплуатацию завода по производству воска Фишера-Тропша (FTWEP) на своем предприятии в Сасолбурге с целью расширения операций Sasol в Южной Африке. Это расширение является частью региональной стратегии компании и обязательств компании по промышленным инвестициям в Южную Африку.
- В октябре 2019 года Cepsa объявила о продлении соглашения с ExxonMobil на производство, распространение и поставку судовых смазочных материалов марки Mobil в более чем 130 портов Испании, Португалии и Гибралтара.
Запрос перед покупкой: https://www.thebrainyinsights.com/enquiry/buying-inquiry/12514
Полностью очищенный воск занимал основную долю рынка и был оценен в 2,76 миллиарда долларов США в 2020 году
Типовой сегмент делится на полностью очищенный парафин и полуочищенный парафин. Полностью очищенный воск занимал основную долю рынка и был оценен в 2,76 миллиарда долларов США в 2020 году. Полностью очищенный парафиновый воск представляет собой воск наивысшей степени чистоты и обычно используется в таких областях, как медицина, пищевая и косметическая промышленность.
Сегмент твердых материалов доминировал на рынке и занимал основную долю рынка в размере 70,56% в 2020 году
Сегмент формы включает твердые и жидкие вещества. Твердый сегмент доминировал на рынке и занимал основную долю рынка в 70,56% в 2020 году. Твердый парафиновый воск широко используется для изготовления свечей и в упаковочной промышленности в качестве воскового покрытия для пленок, бумаги и подложек из фольги, включая гофрокартон. , чашки и контейнеры.
Сегмент косметических средств, по оценкам, будет расти с самым высоким среднегодовым темпом роста в 6 баллов.1% в течение прогнозируемого периода.
Сегмент приложений включает свечи, упаковку, косметику, термоклеи, проклейку картона, резину и другие. Сегмент косметических средств, по оценкам, вырастет с максимальным среднегодовым темпом роста в 6,1% в течение прогнозируемого периода. Парафиновый воск обладает барьерными свойствами для воздуха и воды, что открывает множество возможностей для его применения в косметической промышленности. Развитие мировой косметической индустрии обусловлено развитием электронной коммерции, инновациями и ростом розничной торговли в сфере туризма по всему миру.В дополнение к этому, растущий спрос на косметические продукты в развивающихся странах, таких как Индия, Китай, Бразилия и страны Юго-Восточной Азии, еще больше стимулирует рост рынка.
Анализ регионального сегмента рынка парафинов
- Северная Америка (США, Канада, Мексика)
- Европа (Германия, Франция, Великобритания, Италия, Испания, остальная Европа)
- Азиатско-Тихоокеанский регион (Китай, Япония, Индия, остальные страны Азиатско-Тихоокеанского региона)
- Южная Америка (Бразилия и остальная часть Южной Америки)
- Ближний Восток и Африка (ОАЭ, Южная Африка, остальные страны Ближнего Востока и Африки)
Напрямую. Приобретите копию отчета по TOC @ https://www.thebrainyinsights.com/buy-now/12514/один
Регионы, проанализированные для рынка, включают Северную Америку, Европу, Южную Америку, Азиатско-Тихоокеанский регион, Ближний Восток и Африку. Азиатско-Тихоокеанский регион стал крупнейшим рынком парафинового воска и в 2020 году был оценен в 1,69 миллиарда долларов США. Это связано с присутствием в Азиатско-Тихоокеанском регионе таких развивающихся экономик, как Индия и Китай. Потребление парафина в косметике и свечах находится на пике в этих странах, что способствует росту рынка.В дополнение к этому регион способствует высокому производству парафина для различных применений. Китай является ведущей страной в Азиатско-Тихоокеанском регионе благодаря наличию в стране основных поставщиков парафинового воска. С другой стороны, прогнозируется, что регион Ближнего Востока и Африки будет расти высокими темпами роста на мировом рынке парафина из-за роста разведки нефти и газа, что, вероятно, приведет к широкой доступности сырья. запасы парафина в регионе.
Об отчете:
Мировой рынок парафина анализируется на основе стоимости (млрд долларов США), объема (килотоны), экспорта (килотоны) и импорта (килотоны). Все сегменты были проанализированы на глобальной, региональной и страновой основе. Исследование включает в себя анализ более 30 стран по каждому сегменту. Отчет предлагает углубленный анализ движущих факторов, возможностей, ограничений и проблем для получения ключевой информации о рынке. Исследование включает в себя модель пяти сил Портера, анализ привлекательности, анализ сырья, анализ предложения, анализ спроса, анализ сетки позиций конкурентов, анализ распределения и маркетинговых каналов.
О Brainy Insights:
The Brainy Insights — это компания, занимающаяся исследованиями рынка, целью которой является предоставление компаниям действенной информации с помощью анализа данных для улучшения их деловой хватки. У нас есть надежная модель прогнозирования и оценки для достижения целей клиентов, связанных с получением высококачественной продукции в короткие сроки. Мы предоставляем как индивидуальные (конкретные для клиентов), так и групповые отчеты. Наш репозиторий синдикатных отчетов разнообразен по всем категориям и подкатегориям в разных доменах.Наши индивидуальные решения разрабатываются с учетом требований клиентов, независимо от того, хотят ли они расширяться или планируют выпустить новый продукт на мировой рынок.
Свяжитесь с нами
Авинаш Д.
Руководитель отдела развития бизнеса
Телефон: +1-315-215-1633
Эл.
ИСТОЧНИК The Brainy Insights
ОтчетFoundations for Oily Skin Market охватывает будущие тенденции с исследованиями с 2022 по 2029 год — Revlon, Maybelline — корпоративный дух
Foundations for Oily Skin Market Исследование представляет собой разведывательный отчет с тщательными усилиями, предпринятыми для изучения правильной и ценной информации.Данные, которые были рассмотрены, сделаны с учетом как существующих ведущих игроков, так и будущих конкурентов. Подробно изучены бизнес-стратегии ключевых игроков и новых выходящих на рынок отраслей. Хорошо объясненный SWOT-анализ, доля доходов и контактная информация представлены в этом анализе отчета. Он также предоставляет информацию о рынке с точки зрения развития и его возможностей.
Получить образец Копия этого отчета с последними отраслевыми тенденциями и влиянием COVID-19 @: https://www.a2zmarketresearch.com/sample-request/604338
Некоторые из ведущих компаний, влияющих на этот рынок, включают:
Revlon, Maybelline, Dior, CLINIQUE, Estée Lauder, SMASHBOX, L’Oreal, bareMinerals, Hourglass, AJ Crimson, Laura Mercier, alima PURE.
За траекторию роста рынка отвечают различные факторы, которые подробно рассматриваются в отчете. Кроме того, в отчете перечислены ограничения, которые представляют угрозу для мирового рынка Основы для жирной кожи.Этот отчет представляет собой объединение первичных и вторичных исследований, в котором представлены размер рынка, доля, динамика и прогноз для различных сегментов и подсегментов с учетом макро- и микрофакторов окружающей среды. Он также измеряет рыночную власть поставщиков и покупателей, угрозу со стороны новых участников и продуктов-заменителей, а также степень конкуренции на рынке.
Global Foundations for Oily Skin Сегментация рынка:
Сегментация рынка: по типу
Основы для жирной кожи для женщин
Основы для жирной кожи для мужчин
Сегментация рынка: по приложениям
Онлайн-продажи
Офлайн-продажи
Global Foundations for Oily Skin Market Research предлагает :
- Определение мирового рынка Основы для жирной кожи, а также анализ различных влияющих факторов, таких как движущие силы, ограничения и возможности.
- Обширное исследование конкурентной среды мировых фондов для жирной кожи
- Выявление и анализ микро- и макрофакторов, которые влияют и будут влиять на рост рынка.
- Полный список ключевых игроков на мировом рынке Основы для жирной кожи.
- Анализ различных сегментов рынка, таких как тип, размер, приложения и конечные пользователи.
- Он предлагает описательный анализ цепочки спроса и предложения на мировом рынке Основы для жирной кожи.
- Статистический анализ некоторых важных экономических фактов
- Рисунки, диаграммы, графики, изображения для четкого описания рынка.
Получите скидку до 30% на первую покупку этого отчета @: https://www.a2zmarketresearch.com/discount/604338
Анализ затрат на мировом рынке Основы для жирной кожи был проведен с учетом производственных затрат, стоимости рабочей силы и сырья, а также уровня их рыночной концентрации, поставщиков и ценовой тенденции.Другие факторы, такие как цепочка поставок, последующие покупатели и стратегия снабжения, были оценены, чтобы обеспечить полное и всестороннее представление о рынке. Покупатели отчета также будут ознакомлены с исследованием рыночного позиционирования с учетом таких факторов, как целевой клиент, стратегия бренда и ценовая стратегия.
Ключевые вопросы, на которые даны ответы в отчете, включают:
- Какими будут объем рынка и темпы роста к концу прогнозируемого периода?
- . Каковы ключевые тенденции рынка Основы для жирной кожи, влияющие на рост рынка?
- Каковы потенциальные возможности роста и угрозы, с которыми сталкиваются ведущие конкуренты на рынке?
- Каковы основные результаты анализа пяти сил Портера и SWOT-анализа ключевых игроков, действующих на мировом рынке Основы для жирной кожи?
- В этом отчете содержится вся информация об обзоре отрасли, анализе и доходах этого рынка.
- С какими рыночными возможностями и угрозами сталкиваются продавцы на мировом рынке Основы для жирной кожи?
Содержание
Отчет Global Foundations for Oily Skin Market Research за 2021–2028 годы
Глава 1 Основы для жирной кожи Обзор рынка
Глава 2 Глобальное экономическое влияние на промышленность
Глава 3 Конкуренция на мировом рынке со стороны производителей
Глава 4 Мировое производство, выручка (стоимость) по регионам
Глава 5 Глобальное предложение (производство), потребление, экспорт, импорт по регионам
Глава 6 Мировое производство, выручка (стоимость), динамика цен по типам
Глава 7 Анализ глобального рынка по приложениям
Глава 8 Анализ производственных затрат
Глава 9 Производственная цепочка, стратегия снабжения и последующие покупатели
Глава 10 Анализ маркетинговой стратегии, дистрибьюторы/трейдеры
Глава 11 Анализ факторов влияния на рынок
Глава 12 Глобальные основы для прогноза рынка жирной кожи
Купить эксклюзивный отчет: https://www.a2zmarketresearch.com/checkout
Если у вас есть какие-либо особые требования, сообщите нам об этом, и мы предложим вам отчет, который вы хотите.
Об исследовании рынка A2Z:
Библиотека маркетинговых исследований A2Z содержит отчеты о синдикации от исследователей рынка со всего мира. Готовые к покупке синдикации Исследования рынка помогут вам найти наиболее актуальную бизнес-аналитику.
Наш аналитик-исследователь Предоставляет информацию о бизнесе и отчеты об исследованиях рынка для крупных и малых предприятий.
Компания помогает клиентам формировать бизнес-политику и развиваться в этой области рынка. A2Z Market Research интересует не только отраслевые отчеты, касающиеся телекоммуникаций, здравоохранения, фармацевтики, финансовых услуг, энергетики, технологий, недвижимости, логистики, F & B, СМИ и т. д., но также данные вашей компании, профили стран, тенденции, информация. и анализ интересующего вас сектора.
Свяжитесь с нами:
Роджер Смит
1887 УИТНИ МЕСА Д-Р ХЕНДЕРСОН, Невада 89014
sales@a2zmarketresearch.comком
+1 775 237 4147
Основы для жирной кожи, Основы для рынка жирной кожи, Основы для исследования рынка жирной кожи, Основы для жирной кожи, отчет о рынке Основы для жирной кожи, комплексный отчет о рынке Основы для жирной кожи, прогноз рынка Основы для жирной кожи, Основы для роста рынка жирной кожи, Основы для Рынок жирной кожи в Азии, Фонды рынка жирной кожи в Австралии, Фонды рынка жирной кожи в Европе, Фонды рынка жирной кожи во Франции, Фонды рынка жирной кожи в Германии, Фонды рынка жирной кожи, всесторонний анализ рынка, влияние COVID 19 на Основы для жирной кожи, Revlon, Maybelline, Dior, CLINIQUE, Estée Lauder, SMASHBOX, L’Oreal, bareMinerals, Hourglass, AJ Crimson, Laura Mercier, alima PURE
XLJDD может предотвратить развитие колоректальных опухолей
Введение
Согласно исследованию Международного агентства по изучению рака (IARC), колоректальный рак (CRC) является третьим по распространенности и вторым по смертности типом среди 36 видов рака.По оценкам, в 2020 году будет зарегистрировано более 1,9 миллиона новых случаев заболевания и 935 000 смертей, что составит примерно 1/10 от общего числа смертей от рака. 1 Язвенный колит (ЯК) — длительное заболевание, вызывающее хроническое воспаление и язвы в толстой и прямой кишке, являющееся фактором риска высокой заболеваемости КРР. 2,3 Хотя точный механизм, с помощью которого ЯК-ассоциированный КРР (ЯК-КРР) до сих пор неясен, появляется все больше доказательств того, что аномальные изменения транскриптомов, протеомики и опухолевого окружения могут способствовать их возникновению и прогрессированию. 2,4 В настоящее время препараты для лечения ЯК-КРР минимальны. Поэтому важно разработать новые препараты для клинического лечения ЯК-КРР.
Разработка лекарств от опухолей впервые проводится на животных моделях. До настоящего времени для изучения лекарственных средств применялось большое количество моделей на животных, включая модель подкожной опухоли, модель ортотопической опухоли и модель азоксиметана (АОМ)/декстрансульфата натрия (DSS). 5–7 Среди них модель мышей AOM/DSS широко используется для номинации UC-CRC. 8,9 Комбинация ОСО и воспалительного агента DSS уменьшила латентный период. Регулярное использование DSS в питьевой воде может привести к быстрому росту опухолей толстой кишки в течение десяти недель, в то время как инкубационный период других моделей составляет не менее 30 недель. 10 Кроме того, появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что процесс образования колоректальных опухолей, вызванных AOM/DSS, подобен процессу развития НЯК-КРР у людей, что позволяет нам изучать эффекты и механизмы действия лекарств на НЯК-КРР. 6
Ранние исследования модели AOM/DSS в основном сосредоточены на одном молекулярном механизме.В настоящее время мы можем всесторонне изучить патогенез модели AOM/DSS с помощью технологий высокопроизводительного секвенирования, таких как транскриптомное секвенирование, протеомное секвенирование и транскриптомное секвенирование отдельных клеток. 11–17 Применение транскриптомики и протеомики может отображать тысячи профилей экспрессии РНК и белков на одном изображении. С помощью технологии секвенирования РНК одной клетки можно одновременно описать карту тысяч клеток. Спрос на анализ больших данных вызвал бурное развитие биоинформатики в последние годы. 16,17 Например, Subramanian et al предложили программное обеспечение для анализа обогащения набора генов (GSEA), которое может помочь нам получить важные пути на основе большого количества данных профилей экспрессии генов. 18 Лангфельдер и др. открыли R-пакет для взвешенного корреляционного сетевого анализа (WGCNA) — метода системной биологии, описывающего паттерны ассоциации генов между различными образцами. Метод WGCNA может идентифицировать хорошо скоординированные наборы генов и биомаркеры-кандидаты на основе взаимосвязанности генов. 19
рецепта китайской медицины основаны на руководстве теории традиционной китайской медицины, которая состоит из различных лекарств в соответствии с определенным соотношением качества для конкретных заболеваний. 20 Многие рецепты китайской медицины были изучены в азиатских странах и доказали свою эффективность при некоторых хронических заболеваниях. 21 Наша лаборатория занималась оценкой клинической эффективности и исследованием потенциальных молекулярных механизмов рецептов традиционной китайской медицины и провела оценку классического рецепта отвара Xiao-Ai-Jie-Du (XAJDD), разработанного Pro.Чжоу Чжунъин, мастер китайской медицины. 22,23 Недавно мы сосредоточились на другом рецепте китайской медицины, отваре Xian-Lian-Jie-Du (XLJDD), разработанном Pro. Cheng Haibo благодаря превосходному эффекту контроля прогрессирования колоректального рака, основанному на нашем клиническом наблюдении. Однако механизм XLJDD на UC-CRC до сих пор не раскрыт.
Материалы и методы
Мышь, индуцированная AOM/DSS, модель
самца мышей C57BL/6N (возраст 6 недель, масса тела 18–22 г, номер сертификата животного: SCXK2016-0006) были приобретены у компании Beijing Wei Tong Li Hua Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай) и содержались в контролируемых условиях температуры (21±2°C) и влажности (40–60%) с 12-часовым циклом свет/темнота. Пищу и воду давали по мере необходимости, клетки меняли каждую неделю.
Мыши были интраперитонеально. вводили азоксиметан (АОМ, 10 мг/кг массы тела). Через одну неделю мышей лечили 2% декстрансульфатом натрия (DSS) в питьевой воде в течение семи дней, позволяя 5 мл раствора DSS на мышь в день. Затем DSS заменили питьем автоклавированной воды в течение четырех недель.Во втором цикле и третьем цикле мышей лечили 2% раствором декстрансульфата натрия (DSS) в питьевой воде в течение семи дней, а затем заменяли питьем автоклавированной воды на две недели. Препарат вводили один раз в день, начиная со дня после употребления DSS, и вводили шесть дней подряд в течение одной недели. Массу тела мышей регистрировали каждую неделю, а выживаемость и общее состояние здоровья мышей регистрировали ежедневно. Концентрация XLJDD рассчитывается путем преобразования массы на основе эффективных клинических данных.Предыдущее исследование, проведенное нашей командой, установило три концентрации: высокую (26 г/кг), среднюю (12,9 г/кг) и низкую (6,5 г/кг) для предварительного эксперимента. Экспериментальные результаты показали, что концентрация 12,9 г/кг в эксперименте на животных XLJDD была подходящей ( Рисунок S1A – C ). В частности, концентрации P1-P5 составляли 2,55 г/кг, 2,25 г/кг, 2,7 г/кг, 1,35 г/кг, 4,05 г/кг. Препараты вводили через желудочный зонд, а контрольная группа получала равный объем физиологического раствора.
Сто десять мышей-самцов были случайным образом разделены на одиннадцать групп, включая контрольную группу (нормальный физиологический раствор), группу модели NF-MOD (модель AOM-DSS с нормальным питанием), группу модели HDF-MOD (модель AOM-DSS с высоким жирная диета), группа NF-XLJDD (нормальная диета, модель AOM-DSS с XLJDD), группа HDF-XLJDD (модель AOM-DSS с высоким содержанием жиров и XLJDD), модельная группа P1 (XLJDD ингредиенты 1), модельная группа P2 (XLJDD ингредиенты 2), модельная группа P3 (ингредиенты 3 XLJDD), модельная группа P4 (ингредиенты 4 XLJDD), модельная группа P5 (ингредиенты 5 XLJDD) и группа положительного контроля (фолиевая кислота).Все эксперименты на животных были одобрены нашим Комитетом по этике животных Нанкинского университета китайской медицины (201911A027, 201905A014, 202105A042). Эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями по этической экспертизе благополучия лабораторных животных в Нанкинском университете китайской медицины.
Подготовка XLJDD
Все травы были идентифицированы профессором Си-ли Цзоу (Нанкинский университет китайской медицины). Agrimoniae Herba (Xian-He-Cao), Coptidis Rhizoma (Huang-Lian), Astragali Radix Praeparata Cum Melle (Zhi-Huang-Qi), Coicis Semen (Yi-Yi-Ren) были погружены в воду (1:10, ). вес/объем ) за 0.5 ч, затем нагревают до кипения и выдерживают в течение 2 ч. Водный экстракт фильтровали, а остаток снова заваривали водой (1:8, мас./об. ) в тех же условиях. Фильтрат объединяли и осаждали 60%-ным спиртом в течение 1 суток. Раствор удаляли выпариванием на роторном испарителе и концентрировали до 2 г лекарственного средства на миллилитр. Экстракт хранили при -20°С.
Анализ UPLC-LTQ-MS для XLJDD
Значимые компоненты XLJJD были определены с использованием подхода UPLC-LTQ-Orbitrap-MS.Качественный анализ выполнен на системе УЭЖХ серии Ultimate 3000 (Dionex, США) в сочетании с масс-спектрометром LTQ-Orbitrap Velos Pro (Thermo, США). Разделение проводили на ACQUITY UPLC BEH C 18 1,7 мкм (2,1 мм × 100 мм, Waters) при 30°C со скоростью потока 0,4 мл/мин. (A) 0,1% муравьиной кислоты в воде и (B) ацетонитрил использовали в качестве подвижной фазы. Программа градиента подвижной фазы была следующей: 0–4,5 мин, 5% В; 4,5–6,0 мин, 5–15% В; 6,0–7,5 мин, 15% В; 7.5–9 мин, 15–18% Б; 9–11 мин, 18–27% В; 11–16 мин, 27–35% Б; 16–18 мин, 35–60% В; 18–20 мин, 60–5% Б. Пробы выдерживали при 4°С в течение всего анализа, объем вводимой пробы составлял 2 мкл. Введение образца и ионизацию детектировали с помощью ионизации электрораспылением (ESI) в режиме положительных ионов. Сбор данных МС проводили в диапазоне m/z = 100–1000. Параметры МС были следующими: температура капилляра 275 °С, поток защитного газа (N2) 40 кПа, поток вспомогательного газа (Не) 15 кПа.Масс-спектрометрия второго порядка была получена в режиме зависимого от данных анализа с включенным динамическим исключением и выбран верхний пик верхнего уровня для диссоциации, индуцированной столкновениями (CID). Всеми операциями руководил и помогал персонал общественной инструментальной платформы Нанкинского университета китайской медицины. Подробные результаты соединений показаны на рисунке 1A и в дополнительных материалах 1 . Эти работы были выполнены Pro. Шулан Су из Нанкинского университета китайской медицины.
Рисунок 1 Ослабление эффектов XLJDD на прогрессирование опухоли, вызванное AOM/DSS. ( A ) Суммарные хроматограммы типичных экстрактов из отвара Xian-Lian-Jie-Du с использованием UPLC-LTQ-Orbitrap-MS. ( B ) Схематический обзор построения модели мышей AOM/DSS. ( C ) Морфологическое отображение колоректальных тканей в каждой группе. ( D ) Окрашивание H&E колоректальных парафиновых срезов (продольный и горизонтальный срезы парафиновых срезов).( E ) Иммуногистохимическое окрашивание экспрессии Ki-67 в колоректальных тканях. ( F и G ) Массу тела мышей контролировали еженедельно. ( H и I ) Измеряли количество и объем узелков. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, n=7; * Р <0,05, ** Р <0,01. |
Транскриптомное секвенирование
Секвенирование РНКбыло выполнено в Novogene Bioinformatics Technology Co.Ltd. (Пекин, Китай). Суммарную РНК по протоколу производителя выделяли с помощью Trizol (Invitrogen, США). Деградацию РНК и загрязнение контролировали на 1% агарозных гелях. Чистоту РНК проверяли с помощью спектрофотометра NanoPhotometer ® (IMPLEN, Калифорния, США). Соотношение длин волн A260/A280 и A260/A230 использовали для контроля качества РНК. Концентрацию РНК измеряли с использованием набора для анализа РНК Qubit ® на флуорометре Qubit ® 2.0 (Life Technologies, Калифорния, США).Целостность РНК оценивали с использованием набора для анализа РНК Nano 6000 системы Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Калифорния, США). Качество библиотеки оценивали на Agilent Bioanalyzer 2100. Кластеризация образцов с индексным кодом выполнялась в системе генерации кластеров cBot с использованием набора TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumia) в соответствии с инструкциями производителя. После создания кластера препараты библиотек секвенировали на платформе Illumina HiSeq 2500/2000 и генерировали односторонние чтения длиной 50 п.н.Профили экспрессии анализировали по стандартной методике.
Протеомическое секвенирование
Количественный протеомный анализDIA выполнен компанией Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Пекин, Китай). Количественный протеомный анализ DIA использовали для идентификации дифференциально экспрессируемых белков между различными группами. Белок колоректальных тканей экстрагировали с помощью реагента для экстракции белка. Чистоту белка подтверждали с помощью SDS-PAGE, а концентрацию белка определяли с помощью набора Protein Quantitative Kit (Bradford).После обработки трипсином фильтрат собирали и лиофилизировали. После построения библиотеки спектров DDA был выполнен режим анализа LC-MS/MS-DIA. Анализы в основном включали фильтрацию необработанных данных и контроль качества, аннотацию функции белка.
Секвенирование одноклеточной РНК
Анализ секвенирования одноклеточной РНК выполнен компанией Genergy Bio-Technology Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Суспензию одиночных клеток загружали на контроллер Chromium (10X Genomics) в концентрации 1000 клеток на мкл (библиотека Single Cell 3′ и набор Gel Bead Kit v.3) как описано в протоколе производителя. Создание гелевых шариков в эмульсии (GEM), штрих-кодирование, очистка GEM-RT, амплификация комплементарной ДНК и создание библиотеки выполнялись в соответствии с протоколом производителя. Qubit использовался для количественной оценки библиотеки перед объединением. Окончательный пул библиотек был секвенирован на платформе Illumina HiSeq 2500 с использованием чтения парных концов из 150 пар оснований.
Биоинформатический анализ
Программное обеспечениедля анализа обогащения набора генов (GSEA) (версия 4.0, www.broadinstitute.org/gsea/) использовали для идентификации наборов генов, которые были значительно перепредставлены между двумя группами, такими как группа NF-MOD и группа NF-XLJDD. Программное обеспечение GSEA v4.0 использовалось для изучения распределения членов наборов генов из базы данных MSigDB. 18 В этом биоинформатическом анализе, если большинство членов в наборе генов положительно или отрицательно коррелировали с лечением XLJDD, набор называли ассоциированным с XLJDD.
В соответствии с рабочим процессом WGCNA мы вводим данные экспрессии, обнаруженные каждой группой, в программное обеспечение R studio.Интересующие генные модули могут быть идентифицированы с помощью алгоритма WGCNA, а внутримодульная связность и значимость генов, основанные на корреляции профиля экспрессии генов с образцом признака, использовались для дальнейшей проверки идентификации ключевых генов. WGCNA был свободно доступным пакетом R для построения взвешенных сетей коэкспрессии генов. 19
Иммуногистохимический анализ
Ткани фиксировали в 4% параформальдегиде, обезвоживали и заливали в парафин.После изготовления парафиновых срезов вырезали срезы толщиной 4 мкм и запекали при 60°С в течение ночи. Срезы обрабатывали путем теплового извлечения антигена в цитратном буфере. Кусочки промывали PBS с последующей пермеабилизацией 0,2% Triton X-100. Затем части обрабатывали 2% H 2 O 2 для инактивации активности эндогенной пероксидазы. Срезы промывали 3 раза PBS и инкубировали в течение 2 ч с 3% нормальной козьей сывороткой в PBS. Первичные антитела инкубировали в течение ночи при 4°С, а вторичные антитела инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре.Затем срезы обрабатывали раствором субстрата DAB-хромогена в течение 10 мин и докрашивали гематоксилином, затем обезвоживали. Делали фотографию и рассчитывали процент положительных клеток.
Вестерн-блоттинг
Антитела: Bax (ab32503, Abcam, 1:5000), Bcl-2 (ab196495, Abcam, 1:1000), Ccdc85c (D263389, BBI Life Science, 1:400), Mfsd2a (D261903, BBI Life Science, 1: 1000), β-актин (ab227387, Abcam, 1:5000). Вторичным антителом было вторичное антитело IgG-HRP (7074P2, Cell Signaling Technology, 1:5000).
Вкратце, белки экстрагировали из колоректальной ткани, и концентрации белков в тканях определяли количественно с помощью набора для анализа белков BCA (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Белки разделяли с помощью 10% полиакриламидного геля с додецилсульфатом натрия и переносили на мембрану PVDF, затем блокировали 5% обезжиренным молоком в буфере PBST (буфер PBS, содержащий 0,05% Tween-20) в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны инкубировали в течение ночи с первичными антителами при 4°С. Мембраны после трехкратной отмывки в буфере PBST инкубировали со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре.Сигналы были обнаружены с использованием подложки ECL (Thermo Scientific) и экспонирования с помощью системы визуализации Tanon 5500. Интенсивность полос определяли количественно с помощью денситометрии.
Клинический образец
Колоректальные ткани пациентов с колоректальной опухолью, ассоциированной с ЯК, с XLJDD и без него были получены из провинциальной больницы китайской медицины Цзянсу, Нанкинский университет традиционной китайской медицины (Нанкин, Китай). Эти образцы были идентифицированы двумя патологоанатомами независимо друг от друга.От каждого пациента было получено письменное согласие на использование тканей в нашем исследовании. Это исследование было одобрено комитетами по этике провинциальной больницы традиционной китайской медицины Цзянсу Нанкинского университета китайской медицины (2020NL-09404). Сбор клинических образцов проводился в соответствии с Хельсинкской декларацией.
Колоректальная ортотопическая опухоль мыши, модель
2×10 6 Клетки CT26 вводили в виде подкожной опухоли мышам BALB/c.Через 14 дней мышей умерщвляли, ткань опухоли счищали, ножницы разрезали на кусочки размером 1 мм 3 и вымачивали в физиологическом растворе для последующего использования. Сделать опухолевую ткань in situ инокулированной. После анестезии мыши изофлураном левый разрез в нижней части живота дезинфицировали, слепую кишку извлекали, а серозную оболочку слегка соскабливали иглой в месте соединения слепого узла, чтобы вызвать легкое просачивание крови. В последующем подготовленная опухолевая масса приклеивалась к месту соскоба гистоакриловым клеем, затем осторожно возвращалась в брюшную полость, а брюшина ушивалась.Ткани модели колоректальной ортотопической опухоли для этого исследования были предоставлены Pro.Tan Jiani.
Статистический анализ
Данные были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение по крайней мере из трех независимых экспериментов. Анализ выживаемости выполняли с помощью GEPIA, а для сравнения использовали критерий логарифмического ранга. 24 Статистические результаты были проанализированы с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad Software). Для сравнения двух экспериментальных групп применяли t -критерий Стьюдента.Вероятность 0,05 или меньше считалась статистической значимостью.
Результаты
Ослабление эффектов XLJDD на прогрессирование опухоли, вызванное AOM/DSS
Чтобы изучить эффективность XLJDD в предотвращении UC-CRC, мы создали модель мыши AOM/DSS. Мы построили два типа моделей мышей AOM/DSS, одну для нормальной диеты (NF-MOD), а другую для диеты с высоким содержанием жиров (HDF-MOD). XLJDD применяли для лечения в обеих моделях, а пять основных ингредиентов препарата (P1-P5) использовали только в модели HDF AOM/DSS (рис. 1B).Как показали результаты, длина колоректального пути у контрольной группы была относительно нормальной, а слизистая кишечника гладкой. Конгестии, отека или выраженной гиперплазии не было. В группе NF-MOD и HDF-MOD длина колоректального тракта была укорочена, поверхность слизистой кишечника шероховатая, появились гиперемия, отек, локальные кровяные пятна. По сравнению с модельной группой упомянутые выше симптомы могут быть облегчены после лечения XLJDD. Хотя каждый компонент лекарства (P1-P5) оказывал влияние на уменьшение симптомов на разных уровнях, его эффект оказался слабее, чем в группе XLJDD (рис. 1C).
Затем мы оценили площадь опухолевых поражений с помощью окрашивания H&E и Ki-67. Результаты окрашивания гематоксилин-эозином показали, что в контрольной группе клетки располагались регулярно, ядро клеток располагалось у основания, плоское или кубическое. В группах NF-MOD и HDF-MOD эпителиальные клетки исчезали в полярности, сливались, представляли собой гнезда, отношение ядра к цитоплазме увеличивалось, ядро окрашивалось глубоко, что свидетельствовало о процессе опухолевого генеза. В группе лечения XLJDD расположение эпителиальных клеток было относительно регулярным, и вышеуказанные симптомы в некоторой степени уменьшились (рис. 1D).Результаты окрашивания Ki-67 показали, что эпителиальные клетки в группах NF-MOD и HDF-MOD были значительно более пролиферирующими, чем в контрольной группе, но количество этих пролиферирующих клеток в группе XLJDD было относительно небольшим (рис. 1E). Это открытие предполагает, что XLJDD может ограничивать аномальную пролиферацию эпителиальных клеток. Впоследствии мы оценили массу тела, количество и объем узелков в этих группах. Результаты показали, что нет существенной разницы в массе тела в каждой группе, но лечение XLJDD может уменьшить количество и объем узелков (рис. 1F-I).
Анализ взвешенной сети коэкспрессии генов профилей транскриптома
Чтобы выяснить основной механизм XLJDD, мы определили профили экспрессии мРНК каждой группы с помощью технологии транскриптомики. Всего было обнаружено 21 898 мРНК, и было отсеяно множество дифференциально экспрессируемых генов ( таблиц S1 – S7 ). Учитывая, что метод скрининга дифференциальных генов не может прояснить механизм XLJDD с глобальной точки зрения, мы решили принять WGCNA, метод систематического анализа данных, для изучения критических генов в каждой группе.
В соответствии с рекомендациями по построению WGCNA мы построили сеть совместной экспрессии на основе профилей экспрессии каждой группы. Мы идентифицировали 12 генных модулей, каждый из которых представлен своим цветом (рис. 2А). Путем консервативного анализа можно было бы узнать, что все модули прошли стандартный тест, и все эти 12 модулей заслуживают доверия (рис. 2B). Затем для генов каждого модуля был проведен анализ функционального обогащения, чтобы найти соответствующий путь. Например, ген пурпурного модуля был в основном вовлечен в ответ на воспалительные факторы, а черный модуль был задействован в основном в пути фокальной адгезии (рис. 2С).Наконец, мы идентифицировали модули, наиболее связанные с фенотипом, построив ассоциативную сеть между генными модулями и фенотипами. Как показали результаты, только фиолетовый модуль был наиболее связан с группой NF-XLJDD, что позволяет предположить, что гены пурпурной модели могут быть активированы XLJDD (рис. 2D и E). Кроме того, мы обнаружили, что фиолетовый модуль содержит 14 дифференциальных генов между группами NF-XLJDD и NF-MOD (рис. 2F). Основываясь на анализе обогащения, мы поняли, что эти гены были тесно связаны с путями, связанными с гибелью клеток, что указывает на то, что они могут быть необходимы для функции XLJDD, вызывающей гибель опухолевых клеток (рис. 2G).Анализ GSEA между группами NF-XLJDD и NF-MOD показал, что пути, связанные с интерфероном, были значительно обогащены, что позволяет предположить, что XLJDD, вызывающий гибель клеток, может быть вовлечен в функцию интерферона (рис. 2H). Учитывая, что интерферон может индуцировать гибель опухолевых клеток путем активации апоптоза, мы затем обнаружили маркерный ген апоптоза, и экспериментальные данные подтвердили, что апоптоз имел место ( Рисунок S1D ). Прежде всего, эти результаты показали, что пурпурный модуль, ответственный за реакцию воспалительного фактора, был тесно связан с лечением XLJDD, и 14 дифференциальных генов этого модуля могут опосредовать эффект уничтожения опухолевых клеток XLJDD.
Рисунок 2 Взвешенный анализ сети коэкспрессии генов профилей транскриптома. ( A ) График матрицы топологического перекрытия (TOM), показывающий корреляции каждого модуля. ( B ) Были представлены средний ранг сохранности модулей и итоговая оценка всех модулей. ( C ) Анализ функционального обогащения для различных модулей, соответствующих цветам. ( D ) Корреляции между модулями и группой NF-XLJDD.( E ) Тепловая карта корреляций между модулями и каждой группой. Цвета соответствуют корреляциям, в то время как красный означает положительную корреляцию, а синий означает отрицательную корреляцию. Значения корреляции и значения P также помечены. ( F ) Диаграммы Венна для сравнения пурпурного модуля и генов с дифференциальной экспрессией (гены DE) между группами NF-XLJDD и NF-MOD. ( G ) Анализ обогащения 14 дифференциальных генов. ( H ) Анализ обогащения набора генов показал пути обогащения между группами NF-XLJDD и NF-MOD. |
Mfsd2a может быть супрессором опухоли, активируемым XLJDD
Как упоминалось выше, мы обнаружили, что дифференциальные гены могут иметь решающее значение для XLJDD. Затем мы проанализировали тенденцию экспрессии их гомологичных генов у пациентов с CRC и их клиническую корреляцию. В наборе данных TCGA-COAD человека мы обнаружили, что Mfsd2a, Nos2, Trim15, Tifa и Ptk6 значительно активировались в тканях CRC, в то время как Slc5a9, Tac1, Socs3, S100a8, Tat были значительно снижены в тканях CRC, а уровни экспрессии Ak4 и Reg3g не были значительными (рис. 3А).Интересно, что хотя набор данных TCGA показал высокую экспрессию Mfsd2a в опухолевых тканях CRC, прогностические данные показали, что пациенты с CRC с высокой экспрессией Mfsd2a жили дольше (рис. 3B). Это, казалось бы, противоречивое свидетельство побудило нас поискать литературу по Mfsd2a. Затем мы узнали, что Mfsd2a экспрессируется в клетках CRC и CD8+T-клетках, сосудистых клетках и других клетках микроокружения опухоли. Mfsd2a, экспрессируемый в разных клетках, может иметь совершенно разные функции. 25 Ungaro et al. сообщили, что эндотелиальные клетки-предшественники, которые сверхэкспрессируют Mfsd2a, могут уменьшить колит у мышей, заявив, что Mfsd2a обладает потенциалом устранять воспаление кишечника у пациентов с колитом. 26 В наших результатах данные свидетельствуют о том, что XLJDD активирует экспрессию Mfsd2a (рис. 3C), предполагая, что XLJDD может предотвращать прогрессирование UC-CRC, зависящее от Mfsd2a. Чтобы подтвердить взаимосвязь между Mfsd2a и XLJDD, мы исследовали их в тканях толстой кишки моделей ортотопической колоректальной опухоли мыши и пациента с UC-CRC.Анализы IHC показали, что экспрессия Mfsd2a увеличивалась при лечении XLJDD (рис. 3E). Результаты количественной ПЦР показали, что уровни мРНК Mfsd2a могут повышаться, что позволяет предположить, что изменения в Mfsd2a могут быть вызваны на уровне транскрипции (рис. 3D). Эти результаты показали, что регуляторная взаимосвязь между Mfsd2a и XLJDD может быть консервативной.
Рисунок 3 Mfsd2a может быть супрессором опухоли, активируемым XLJDD.( A ) Экспрессия генов-кандидатов в раковых тканях (красный) сравнивается с нормальными тканями (черный) в наборе данных TCGA-COAD. ( B ) Анализ выживаемости Каплана-Мейера экспрессии Mfsd2a (низкий против высокого). ( C ) Экспрессия Mfsd2a в наших результатах транскриптомного секвенирования. ( D ) Результаты экспрессии Mfsd2a, измеренные с помощью количественной ПЦР. ( E ) Репрезентативные изображения для окрашивания IHC Mfsd2a. * Р <0,05, ** Р <0,01. |
Анализ взвешенной сети коэкспрессии генов протеомного профилирования экспрессии
Затем мы попытались изучить механизм XLJDD на уровне белка.Всего было обнаружено 6856 белков, и с помощью метода WGCNA было идентифицировано восемь белковых модулей с различными паттернами экспрессии (рис. 4А-С). С помощью анализа обогащения мы нашли функциональные пути, соответствующие каждому модулю. Например, мы обнаружили, что черный модуль соответствует процессу клеточного апоптоза, коричневый модуль соответствует пути фокальной адгезии, а зеленый модуль соответствует процессу цитратного цикла (рис. 4D). После этого мы построили матрицу корреляции фенотип-модуль и обнаружили, что группа NF-XLJDD значительно положительно коррелировала с синим модулем, а группа HDF-XLJDD была значительно положительно связана с черным модулем и зеленым модулем.Более того, мы также обнаружили, что первичный компонент P2 положительно коррелировал с красным модулем, а P4 положительно коррелировал с зеленым и бирюзовым модулями (рис. 4E-G). Сравнивая дифференциально экспрессируемые белки в соответствующих модулях, мы обнаружили, что некоторые белки могут быть важны для функции XLJDD. Например, Rpl6, Ccdc85c, Ctrb1, Mgp, Naaladl1 и Rpl36a могут играть жизненно важную роль в группе NF-XLJDD. Meak7, Seroina1b, Mpz и Seroina1a могут быть действительными в группе HDF-XLJDD.Некоторые белки, такие как Daglb и Haxb, могут быть необходимы для P4 (рис. 4H, , таблицы S8 – , S14 ).
Рисунок 4 Взвешенный анализ сети коэкспрессии генов протеомных профилей. ( A ) График матрицы топологического перекрытия (TOM), показывающий корреляции каждого модуля. ( B ) Были представлены средний ранг сохранности модулей и итоговая оценка всех модулей. ( C ) Паттерн экспрессии собственных генов в каждой группе.( D ) Корреляции между различными модулями и их соответствующими путями. ( E ) Тепловая карта корреляций между модулями и каждой группой. Цвета соответствуют корреляциям, в то время как красный означает положительную корреляцию, а синий означает отрицательную корреляцию. Значения корреляции и значения P также помечены. ( F ) Корреляции между функциональными модулями и группами NF-XLJDD, HDF-XLJDD, P2 и P4 соответственно. ( G ) Отображены карты членства модуля со значением гена.( H ) Диаграмма Венна дифференциальных генов в NF-XLJDD, HDF-XLJDD, P2 и P4 и соответствующих им модулях. |
Ccdc85c может быть эффективной целью для XLJDD
АнализGSEA был впервые применен для поиска белковых путей, измененных XLJDD. Мы обнаружили, что пути адипогенеза, метаболизма жирных кислот и окислительного_фосфорилирования были значительно обогащены в группах NF-XLJDD и HDF-XLJDD по сравнению с группами NF-MOD и HDF-MOD соответственно.Пути гипоксии, миогенеза и окислительного фосфорилирования были обогащены в группе P2. В группе P4 были обогащены E2F_targets, G2M_checkpoint и p53_pathway (рис. 5A). Затем мы попытались определить основной белок, поддерживающий функцию XLJDD. Совместный анализ с результатами рисунка 4H и набором данных TCGA, мы отметили, что Ccdc85c модулируется XLJDD и подавляется в опухолевой ткани пациентов с CRC. Время выживания пациентов с высокой экспрессией Ccdc85c было значительно больше, чем у пациентов с низкой экспрессией (фиг. 5B и C).Результаты количественной ПЦР показали, что уровни мРНК Ccdc85c не могут быть изменены, что свидетельствует о том, что изменения уровней белка Ccdc85c не вызываются на уровне транскрипции. (Рисунок 5D).
Рисунок 5 Ccdc85c может быть эффективной мишенью для XLJDD. ( A ) Анализ обогащения набора генов показал пути обогащения между двумя группами. ( B ) Уровни экспрессии Ccdc85c и анализ выживаемости Каплана-Мейера по данным TCGA.( C ) Экспрессия Ccdc85c в наших результатах протеомного секвенирования. ( D ) Результаты экспрессии Ccdc85c, измеренные с помощью количественной ПЦР. * P <0,05, нс, не значимо. |
Изменение микроокружения опухоли, вызванное XLJDD
На основании приведенных выше результатов мы обнаружили критические гены в группе NF-XLJDD с помощью профилей транскриптома и протеома. Однако мы до сих пор не исследовали механизм группы HDF-XLJDD.В настоящее время все больше исследований показали, что микроокружение опухоли является ключом к возникновению и развитию опухолевых клеток, и было идентифицировано множество лекарств, нацеленных на микроокружение опухоли для терапии опухолей. 27 Таким образом, мы решили исследовать механизм XLJDD в группе HDF-XLJDD с точки зрения микроокружения опухоли. Мы выбрали группы контроля, HDF-MOD и HDF-XLJDD для секвенирования одноклеточной РНК. Наши результаты показали, что для анализа было захвачено в общей сложности 45 388 клеток.Захваченные клетки были подвергнуты анализу уменьшения размерности, и в общей сложности было получено 29 кластеров (рис. 6А-Е). Мы обнаружили, что соотношение клеток было значительно изменено в группе HDF-MOD по сравнению с контрольной группой, но было спасено в группе HDF-XLJDD. Например, соотношение кластера 2 и кластера 17 значительно увеличилось в группе HDF-MOD, в то время как их процент в группе HDF-XLJDD снизился и был близок к таковому в контрольной группе (рис. 6F). Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что XLJDD может играть роль супрессора опухоли, влияя на состав клеток микроокружения опухоли в группе HDF-XLJDD.
Рисунок 6 Изменение микроокружения опухоли, вызванное XLJDD. ( A ) Результат PCA профилей секвенирования отдельных клеток. ( B ) График t-распределенного стохастического встраивания соседей (t-SNE) всех ячеек из контрольной группы, групп HDF-MOD и HDF-XLJDD. ( C ) График равномерной аппроксимации и проекции коллектора (UMAP) всех клеток из контрольной группы, группы HDF-MOD и HDF-XLJDD. ( D ) График t-SNE для контроля, групп HDF-MOD и HDF-XLJDD.( E ) Корреляции между различными кластерами. ( F ) Гистограмма соотношения кластеров в контроле, группах HDF-MOD и HDF-XLJDD. |
Интересно, что с помощью предсказания типа клеток мы обнаружили, что кластеры клеток, спасенные с помощью XLJDD, такие как кластер 2, кластер 17, кластер 23 и кластер 25, были предсказаны как В-клетки (рис. 7А). Результаты дальнейшего анализа показали, что В-клетки можно разделить на различные подкатегории на основе их маркерных молекул, таких как (CD74 + EBF1 + CD79A + h3Aa + ) В-клетки и (IgIc1 + Igha + Igkc + Jцепь + ) В-клеток (фиг. 7В).Более того, мы обнаружили, что путь окислительного фосфорилирования был обогащен независимо от лечения XLJDD. Однако только путь ферроптоза был обогащен после лечения XLJDD в этих четырех кластерах. Эти результаты указывают на то, что регуляция В-клеток с помощью XLJDD может быть опосредована путем ферроптоза (рис. 7C-J). Прежде всего, XLJDD может подавлять онкогенез и развитие в группах HDF-XLJDD, изменяя микроокружение опухоли, особенно соотношение состава В-клеток.
Рисунок 7 Идентификация кластеров В-клеток с помощью атласа одиночных клеток. ( A ) График t-SNE и график UMAP показали предсказанный тип клеток. ( B ) График t-SNE кластера с экспрессией маркерных генов, красные точки представляют клетки с высокой экспрессией маркерного гена в общем числе обнаруженных клеток. ( C – F ) Анализ обогащения дифференциальных генов в В-клетках (кластер 2, кластер 17, кластер 23, кластер 25) между контрольной группой и группами HDF-MOD.( G – J ) Анализ обогащения дифференциальных генов в В-клетках (кластер 2, кластер 17, кластер 23, кластер 25) между группами HDF-MOD и HDF-XLJDD. |
Обсуждение
Наша команда в течение нескольких лет занимается изучением механизма рецептов классической китайской медицины и клинически эффективных рецептов, таких как знаменитый рецепт Сяо-Ай-Цзие-Ду. Недавно наше внимание привлек еще один рецепт китайской медицины, XLJDD.Было обнаружено, что некоторые пациенты с НЯК-КРР, принимающие XLJDD, могут эффективно замедлять прогрессирование опухоли. Чтобы проиллюстрировать механизм XLJDD, наша команда запланировала провести клинические испытания на животных и молекулярные эксперименты, чтобы объяснить его потенциальный механизм действия. В настоящее время завершены эксперименты на животных, включая модели AOM/DSS, ортотопические модели колоректальных опухолей и модели подкожных опухолей.
В этом исследовании мы в основном использовали модель AOM/DSS для имитации прогрессирования ЯК-КРР для изучения механизма XLJDD при лечении ЯК-КРР.Мы использовали ортотопические модели и клинические образцы тканей для уточнения результатов высокопроизводительного секвенирования. Стоит отметить, что в нашем исследовании было принято несколько высокопроизводительных технологий секвенирования. В результате были обнаружены тысячи генов и белков, а также отображена карта инфильтрации иммунными клетками микроокружения опухоли. Как упоминалось выше, было идентифицировано несколько важных модулей, и соответствующий путь, такой как путь уничтожения клеток, был обогащен. В результатах секвенирования отдельных клеток мы также обнаружили, что XLJDD может регулировать способность множественных иммунных клеток к инфильтрации в микроокружении опухоли.Доля В-клеток в группе XLJDD была значительно ниже, чем в модельной группе, которая была почти аналогична контрольной группе, что позволяет предположить, что модуляция XLJDD инфильтрации иммунных клеток в микроокружении опухоли была необходима для его терапевтического эффекта. Ранее другие исследователи также идентифицировали несколько ключевых молекул опухоли с помощью высокопроизводительной технологии. 28,29 Например, Manoochehri et al. обнаружили, что CDC25A является ключевым геном, определяющим прогноз колоректального рака. 30 Khoei et al. обнаружили, что миР-299-5p является важным прогностическим фактором для различных опухолей. 31
Хотя технология с высокой пропускной способностью может предоставить нам объективную перспективу для понимания данных XLJDD и обогатить наше понимание механизма действия, она также вносит некоторую путаницу. Как показано на рисунке S1E , даже для одного и того же образца согласованность данных об экспрессии РНК и данных об экспрессии белка по-прежнему сильно отличалась, что позволяет предположить, что экспрессия РНК не обязательно может приводить к экспрессии белка.Этому есть много причин, которые могут быть вызваны несколькими этапами, такими как посттранскрипционная модификация, 32 альтернативные сплайсинги, 33 трансляция белка, 34 и посттрансляционная модификация. 35 Совместный анализ данных мРНК-белок вызывает у нас трудности. Однако анализ этих двух типов данных по отдельности также может позволить нам объяснить механизм XLJDD с разных точек зрения.
Как показали результаты, мы обнаружили две важные мишени XLJDD, Mfsd2a и Ccdc85c при транскриптомном секвенировании и протеомном секвенировании соответственно.Исследования этих двух генов в опухолях проводились относительно редко, особенно в колоректальных опухолях. Spinola et al. сообщили, что при раке легкого Mfsd2a является типичным геном-супрессором опухоли, который может играть определенную роль, блокируя развитие фазы G1 и нарушая способность клеток к инвазии. 36 Shi et al. обнаружили более низкую экспрессию Mfsd2a в тканях рака желудка. Экспрессия Mfsd2a при умеренном/высокодифференцированном раке желудка была значительно выше, чем при низкодифференцированном раке желудка, а экспрессия при раннем раке желудка была значительно выше, чем при распространенном раке желудка.Прогноз у Mfsd2a-положительных пациентов был значительно лучше, чем у Mfsd2a-отрицательных пациентов. 37 В этом исследовании мы обнаружили, что XLJDD может значительно активировать экспрессию Mfsd2a. Экспериментальные данные показали, что эта регуляторная взаимосвязь может повторяться при ортотопических колоректальных опухолях и у пациентов с НЯК-КРР, предполагая, что это была консервативная регуляторная взаимосвязь. Интересно, что высокая экспрессия Mfsd2a в клетках-предшественниках эндотелия сосудов может эффективно предотвращать язвенный колит, а активация Mfsd2a необходима для функции CD8+ Т-клеток.Чем выше доля CD8+ Т-клеток в микроокружении опухоли, тем лучше прогноз для пациента. 38 Кроме того, наши результаты также показали, что функция XLJDD не может зависеть от TNF-α ( Рисунок S1E ), предполагая, что XLJDD может предотвращать UC-CRC неклассическим путем. Мы предположили, что регуляторная ось XLJDD-Mfsd2a позволяет многим видам клеток работать вместе для подавления опухолей в микроокружении опухоли. По сравнению с Mfsd2a сообщения о Ccdc85 встречались еще реже.Guo и др. сообщили, что Ccdc85 может активировать бета-катенин и способствовать прогрессированию рака печени. 39 Мы обнаружили, что XLJDD может изменять экспрессию Ccdc85, но конкретный механизм еще предстоит изучить.
Классически известно, что В-клеткиположительно модулируют иммунный ответ и воспаление посредством продукции антител и способствуют активации и пролиферации Т-клеток посредством презентации антигена. 40 Недавно была описана новая роль В-клеток с иммуносупрессивными или регуляторными функциями в модулировании противоопухолевого иммунного ответа. 41 И наоборот, в некоторых исследованиях было показано, что В-клетки обладают защитной, а не иммунодепрессивной функцией. В этом исследовании наши результаты показали, что В-клетки были значительно активизированы в группе модели колоректального рака, но подавлены в группе, получавшей XLJDD, возвращаясь к тому же соотношению, что и в контрольной группе. Эти данные показали, что В-клетки могут играть роль в стимулировании онкогенеза и развития в нашей системе.
Заключение
В заключение мы продемонстрировали, что XLJDD может предотвращать возникновение и развитие колоректальных опухолей, активируя экспрессию Mfsd2a и экспрессию Ccdc85c и уменьшая инфильтрацию В-клеток в среде колоректальной опухоли.В будущих исследованиях мы изучим функции Mfsd2a и Ccdc85c в опухолевых клетках и клетках микроокружения опухоли, чтобы изучить их потенциальные молекулярные механизмы. Кроме того, мы также будем активно изучать возможность XLJDD в сочетании с модуляторами генов-мишеней, надеясь на клиническую эффективность.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить доктора Чжэнцзе Шэня из аффилированной больницы Чжанцзяган Университета Сучжоу за его экспериментальный совет и Pro. Шулан Су из Нанкинского университета китайской медицины за ее работу по проведению анализа XLJDD методом UPLC-TQ-MS.
Финансирование
Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (81804073, 82004310, 81930117).
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов и конфликтов интересов в данной работе.
Каталожные номера
1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, et al. Глобальная статистика рака 2020: GLOBOCAN оценивает заболеваемость и смертность во всем мире от 36 видов рака в 185 странах. CA Рак J Clin . 2021;71(3):209–249. дои: 10.3322/caac.21660
2. Роглер Г. Хронический язвенный колит и колоректальный рак. Рак Летт . 2014;345(2):235–241. doi:10.1016/j.canlet.2013.07.032
3. Яширо М. Колоректальный рак, ассоциированный с язвенным колитом. Мир J Гастроэнтерол . 2014;20(44):16389–16397. дои: 10.3748/wjg.v20.i44.16389
4. Кобаяши Т., Зигмунд Б., Ле Берре К. и соавт. Язвенный колит. Nat Rev Dis Primers .2020;6(1):74. дои: 10.1038/s41572-020-0205-x
5. Ясин М., Садовска З., Джурхуус Д. и соавт. Активация PD-1 следует за развитием опухоли в модели AOM/DSS индуцированного воспалением колоректального рака у мышей. Иммунология . 2019;158(1):35–46. doi:10.1111/имм.13093
6. Де Робертис М., Масси Э., Поэта М.Л. и соавт. Мышиная модель AOM/DSS для изучения канцерогенеза толстой кишки: от путей к диагностике и терапевтическим исследованиям. Дж Карциног . 2011;10:9. дои: 10.4103/1477-3163.78279
7. Паранг Б., Барретт К.В., Уильямс К.С. Модель AOM/DSS рака, связанного с колитом. Методы Мол Биол . 2016;1422:297–307.
8. Wang G, Ma N, He F, et al. Таурин ослабляет канцерогенность в модели язвенного колита и колоректального рака на мышах. Oxid Med Cell Longev . 2020;2020:7935917. дои: 10.1155/2020/7935917
9. Wang W, Li X, Zheng D, et al. Динамические изменения и функции макрофагов и субпопуляций M1/M2 во время канцерогенеза, связанного с язвенным колитом, на модели мышей AOM/DSS. Мол Мед Реп . 2015;11(4):2397–2406. doi:10.3892/ммр.2014.3018
10. Tanaka T, Kohno H, Suzuki R, Yamada Y, Sugie S, Mori H. Новая модель канцерогенеза толстой кишки мыши, связанная с воспалением, индуцированная азоксиметаном и декстрансульфатом натрия. Рак Науки . 2003;94(11):965–973. doi:10.1111/j.1349-7006.2003.tb01386.x
11. Хун М., Тао С., Чжан Л. и др. Секвенирование РНК: новые технологии и приложения в исследованиях рака. J Гематол Онкол . 2020;13(1):166.doi: 10.1186/s13045-020-01005-x
12. Рейтер Дж.А., Спейсек Д.В., Снайдер М.П. Технологии высокопроизводительного секвенирования. молярная ячейка . 2015;58(4):586–597. doi:10.1016/j.molcel.2015.05.004
13. Баслан Т., Хикс Дж. Распутывание биологии и изменение парадигм рака с помощью секвенирования отдельных клеток. Nat Rev Рак . 2017;17(9):557–569. doi:10.1038/nrc.2017.58
14. Тан Х.Т., Ли Ю.Х., Чанг М.С. Протеомика рака. Масс-спектр, версия . 2012;31(5):583–605.дои: 10.1002/mas.20356
15. Li X, Wang W, Chen J. Недавний прогресс в протеомике масс-спектрометрии для биомедицинских исследований. Sci China Life Sci . 2017;60(10):1093–1113. doi: 10.1007/s11427-017-9175-2
16. Оливер Г.Р., Харт С.Н., Клее Э.В. Биоинформатика для клинического секвенирования следующего поколения. Клин Хим . 2015;61(1):124–135. doi:10.1373/clinchem.2014.224360
17. Хванг Б., Ли Дж. Х., Банг Д. Технологии секвенирования одноклеточной РНК и направления биоинформатики. Exp Mol Med . 2018;50(8):1–14. doi:10.1038/s12276-018-0071-8
18. Субраманиан А., Тамайо П., Мута В.К. и соавт. Анализ обогащения набора генов: основанный на знаниях подход к интерпретации профилей экспрессии всего генома. Proc Natl Acad Sci U S A . 2005;102(43):15545–15550. doi:10.1073/pnas.0506580102
19. Лангфельдер П., Хорват С. WGCNA: пакет R для взвешенного корреляционного сетевого анализа. БМС Биоинформ . 2008; 9:559. дои: 10.1186/1471-2105-9-559
20.Нормиле Д. Азиатская медицина. Новое лицо традиционной китайской медицины. Наука . 2003;299(5604):188–190. doi:10.1126/наука.299.5604.188
21. Xu HY, Zhang YQ, Liu ZM, et al. ETCM: энциклопедия традиционной китайской медицины. Рез. нуклеиновых кислот . 2019;47(D1):D976–D982. doi:10.1093/нар/gky987
22. Fan H, Liu S, Shen W, et al. Идентификация абсорбированных компонентов и метаболитов отвара Сяо-Ай-Цзие-Ду и их распределение у крыс с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии/квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрии. J Pharm Биомед Анал . 2020;179:112984. doi:10.1016/j.jpba.2019.112984
23. Цю В.И., Чен Х.Б., Цзян ZQ., Чжоу Х.Г. [Влияние рецепта Xiaoai Jiedu на профили экспрессии мРНК у мышей с опухолями H(2)(2)]. Чжунго Чжун Си И Цзе Хэ За Чжи . 2016;36(9):1112–1118. Китайский язык.
24. Tang Z, Li C, Kang B, Gao G, Li C, Zhang Z. GEPIA: веб-сервер для профилирования экспрессии генов рака и нормальной экспрессии и интерактивного анализа. Рез. нуклеиновых кислот . 2017;45(Н1):В98–В102.doi:10.1093/нар/gkx247
25. Eser Ocak P, Ocak U, Sherchan P, Zhang JH, Tang J. Взгляд на белок-2a, содержащий основной домен надсемейства помощников (Mfsd2a), в физиологии и патофизиологии. Что мы знаем на данный момент? J Neurosci Res . 2020;98(1):29–41. doi:10.1002/jnr.24327
26. Ungaro F, Tacconi C, Massimino L, et al. MFSD2A способствует выработке в эндотелии липидных медиаторов, разрешающих воспаление, и уменьшает колит у мышей. Гастроэнтерология .2017;153(5):1363–1377. doi:10.1053/j.gastro.2017.07.048
27. Рома-Родригес С., Мендес Р., Баптиста П.В., Фернандес А.Р. Ориентация на микроокружение опухоли для терапии рака. Int J Mol Sci . 2019;20(4):840. дои: 10.3390/ijms20040840
28. Manoochehri H, Sheykhhasan M, Samadi P, Pourjafar M, Saidijam M. Системная биологическая и экспериментальная проверка генов-мишеней miRNAs, участвующих в радиационном ответе колоректального рака. Джин Реп . 2019;17:100540. дои: 10.1016/j.genrep.2019.100540
29. Manoochehri H, Jalali A, Tanzadehpanah H, Taherkhani A, Saidijam M. Идентификация ключевых генных мишеней для повышения чувствительности колоректального рака к химиолучевой терапии: интегративный сетевой анализ данных множественной транскриптомики. J Рак желудочно-кишечного тракта . 2021. doi:10.1007/s12029-021-00690-2
30. Manoochehri H, Asadi S, Tanzadehpanah H, Sheykhhasan M, Ghorbani M. CDC25A тесно связан со стволовыми клетками колоректального рака и плохим клиническим исходом пациентов. Джин Реп . 2021;25:101415. doi:10.1016/j.genrep.2021.101415
31. Gholamzadeh Khoei S, Manoochehri H, Saidijam M. Системное биологическое исследование для идентификации генов-мишеней miR-299-5p при раке. Мета Ген . 2020;24:100655. doi:10.1016/j.mgene.2020.100655
32. Чжао Б.С., Раундтри И.А., Хе С. Посттранскрипционная регуляция генов с помощью модификаций мРНК. Nat Rev Mol Cell Biol . 2017;18(1):31–42. doi:10.1038/nrm.2016.132
33. Бонналь СК, Лопес-Ореха И., Валькарсель Х.Роли и механизмы альтернативного сплайсинга при раке – последствия для лечения. Nat Rev Clin Oncol . 2020;17(8):457–474. дои: 10.1038/s41571-020-0350-x
34. Меррик В.К., Павитт Г.Д. Инициация синтеза белка в эукариотических клетках. Колд Спринг Харб Перспект Биол . 2018;10(12):a033092. doi:10.1101/cshperspect.a033092
35. Han ZJ, Feng YH, Gu BH, Li YM, Chen H. Посттрансляционная модификация, SUMOylation и рак (обзор). Интерн. Дж. Онкол .2018;52(4):1081–1094. doi:10.3892/ijo.2018.4280
36. Spinola M, Falvella FS, Colombo F, et al. MFSD2A представляет собой новый ген-супрессор опухоли легких, модулирующий клеточный цикл и прикрепление к матриксу. Мол Рак . 2010;9:62. дои: 10.1186/1476-4598-9-62
37. Shi X, Huang Y, Wang H, Zheng W, Chen S. Экспрессия MFSD2A предсказывает лучший прогноз при раке желудка. Biochem Biophys Res Commun . 2018;505(3):699–704. doi:10.1016/j.bbrc.2018.09.156
38. Маймела Н.Р., Лю С., Чжан Ю.Судьбы CD8+ Т-клеток в микроокружении опухоли. Comput Struct Biotechnol J . 2019;17:1–13. doi:10.1016/j.csbj.2018.11.004
39. Guo Y, Chai B, Jia J, et al. Ось KLF7/VPS35 способствует прогрессированию гепатоцеллюлярной карциномы через CCDC85C-активируемый путь β-катенина. Cell Biosci . 2021;11(1):73. doi:10.1186/s13578-021-00585-6
40. ЛеБьен Т.В., Теддер Т.Ф. В-лимфоциты: как они развиваются и функционируют. Кровь . 2008;112(5):1570–1580. дои: 10.1182/кровь-2008-02-078071
41. Lu Y, Zhao Q, Liao JY, et al. Сигналы комплемента определяют противоположные эффекты В-клеток на иммунитет, вызванный химиотерапией. Сотовый . 2020;180(6):1081–1097, e1024. doi:10.1016/j.cell.2020.02.015
Метаболическая характеристика костных метастазов рака предстательной железы человека выявила повышенный уровень холестерина
Аннотация
Фон
Метастазирование в кости является одним из клинически важных признаков рака предстательной железы (РПЖ).Современные методы диагностики не позволяют прогнозировать метастатический РПЖ на излечимой стадии заболевания. Таким образом, идентификация метаболических путей, участвующих в росте костных метастазов, может улучшить прогнозирование РПЖ, а также терапию.
Методология/основные выводы
Метаболомика применялась для исследования костных метастазов РПЖ (n = 20) в сравнении с соответствующей нормальной костью (n = 14), а также злокачественной (n = 13) и доброкачественной (n = 17) ткани предстательной железы и соответствующих образцов плазмы получены от пациентов с (n = 15) и без (n = 13) диагностированных метастазов и от мужчин с доброкачественным заболеванием предстательной железы (n = 30).Это было сделано с использованием газовой хроматографии-масс-спектрометрии для характеристики образцов и хемометрической биоинформатики для анализа данных. Результаты были проверены в отдельном наборе тестов, включающем метастатическую и нормальную костную ткань пациентов с другими видами рака (n = 7). Были обнаружены значительные различия между метастазами РПЖ в кости, метастазами в кости других видов рака и нормальной костью. Кроме того, мы идентифицировали метаболиты в первичной опухолевой ткани и в плазме, которые были в значительной степени связаны с метастатическим заболеванием.Среди метаболитов при костных метастазах РПЖ особенно отмечен холестерин. В тестовой выборке средний уровень холестерина в костных метастазах РПЖ составил 127,30 мг/г по сравнению с 81,06 и 35,85 мг/г в костных метастазах различного происхождения и нормальной кости соответственно (P = 0,0002 и 0,001). Иммуногистохимическое окрашивание костных метастазов РПЖ показало интенсивное окрашивание рецепторов липопротеинов низкой плотности и различные уровни рецепторов-мусорщиков класса B типа 1 и 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим редуктазы в опухолевых эпителиальных клетках, что указывает на возможность притока и de novo синтез холестерина.
Выводы/значимость
Мы идентифицировали метаболиты, связанные с метастазами РПЖ, и конкретно определили высокие уровни холестерина в костных метастазах РПЖ. Основываясь на наших выводах и предыдущей литературе, это делает холестерин возможной терапевтической мишенью для прогрессирующего РПЖ.
Образец цитирования: Thysell E, Surowiec I, Hörnberg E, Crnalic S, Widmark A, Johansson AI, et al. (2010) Метаболическая характеристика костных метастазов рака предстательной железы человека выявляет повышенный уровень холестерина.ПЛОС ОДИН 5(12): е14175. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014175
Редактор: Chad Creighton, Медицинский колледж Бейлора, США
Получено: 14 июня 2010 г.; Принято: 4 ноября 2010 г .; Опубликовано: 3 декабря 2010 г.
Авторское право: © 2010 Thysell et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.
Финансирование: Грантовая поддержка: Шведское онкологическое общество, Шведский исследовательский совет, Фонд исследований рака Lions, фонд KEMPE, фонд Кнута и Алисы Валленберг и Фонд рака Северной Швеции. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
Введение
Агрессивный рак предстательной железы (РПЖ), который в конечном итоге распространяется на кости, является распространенным и смертельным заболеванием, требующим ранней диагностики и эффективного лечения.современные методы диагностики; измерение уровней простат-специфического антигена (ПСА) в образцах крови и исследование биоптатов предстательной железы под световой микроскопией, однако, не особенно эффективны для отделения случаев агрессивного РПЖ от еще более распространенных и индолентных форм РПЖ, которые часто можно не лечить. лечения или при отделении рака от других незлокачественных заболеваний предстательной железы [1], [2]. Поэтому, используя различные методы, многие исследователи пытались найти новые диагностические методы и прогностические маркеры, которые могут отличить агрессивные формы РПЖ от более индолентных (обзор в [3]).
Много усилий было приложено для распознавания генетических и протеомных профилей РПЖ (обзор в [4]), а магнитно-резонансная спектроскопия использовалась для изучения метаболических изменений, связанных с РПЖ [5], [6], [7]. Zakian и его коллеги предоставили хороший обзор по этому вопросу [8]. Однако в недавней статье Шрикумар и его коллеги использовали жидкостную и газовую хроматографию – времяпролетную масс-спектрометрию (ГХ/ВПМС) для профилирования метаболома в тканях, моче и плазме пациентов с РПЖ и выявили изменения, связанные с прогрессированием заболевания [9]. .В частности, они идентифицировали саркозин, N -метилпроизводное глицина, как потенциально важный маркер инвазии, миграции и агрессивности клеток РПЖ. Исследование Шрикумара вместе с другими недавними исследованиями [10], [11], [12], [13] действительно указывает на то, что методы, основанные на масс-спектрометрии, могут быть использованы для характеристики метаболических изменений во время прогрессирования рака и, кроме того, для определения возможных диагностических и прогностических биомаркеров или паттернов биомаркеров, а также расширить наши знания о прогрессировании заболевания.
Это исследование было проведено с гипотезой о том, что потенциальные новые маркеры агрессивного РПЖ могут быть обнаружены путем обнаружения факторов, заметно активизирующихся в костных метастазах, а затем изучения того, увеличиваются ли те же факторы в образцах крови и в первичных опухолях у пациентов с метастатическим заболеванием. . Поэтому мы провели метаболическое исследование костных метастазов РПЖ по сравнению с соответствующей нормальной костью, первичной опухолью РПЖ и нормальной тканью предстательной железы, используя метастатическую ткань, собранную во время операции по поводу осложнений костных метастазов [14].Кроме того, мы проанализировали образцы крови пациентов с диагностированными метастазами в кости и без них с целью выявления метаболитов, которые можно было бы использовать для улучшения прогноза и лечения распространенного РПЖ. Результаты были проверены в отдельном наборе тестов, в том числе с метастатической костной тканью от других видов рака. Это было сделано с использованием газовой хроматографии-масс-спектрометрии для характеристики образцов и хемометрической биоинформатики для анализа и оценки данных [15].
Результаты
Метастазы рака предстательной железы в кости демонстрируют явные метаболические отличия от нормальной кости и от метастазов в кости других видов рака, включая повышенный уровень холестерина
Газовая хроматография-времяпролетная масс-спектрометрия (ГХ/ВПМС) использовалась для характеристики костных метастазов РПЖ у 14 пациентов (7 пациентов с РПЖ, ранее не получавших гормоны, и 7 пациентов с КРРПЖ) и прилежащих фрагментов костей нормального вида, которые были доступны из 10 пациентов (таблица 1).Всего путем деконволюции [16] было обнаружено 123 хроматографических пика, соответствующих предполагаемым метаболитам, после исключения пиков, происходящих от внутренних стандартов, загрязнения и артефактов. Из 123 предполагаемых метаболитов 49 можно было идентифицировать по их масс-спектрам и соответствующему индексу удерживания (рис. 1). Ортогональный частичный дискриминационный анализ методом наименьших квадратов (OPLS-DA) выявил очевидное и статистически значимое разделение ( P <0,001) между нормальными образцами кости и образцами костных метастазов, независимо от лечения, определенное с помощью ANOVA перекрестной проверки модели (рис. 2b). ).Значимые различия между группами образцов (VIP>0,9, переменная значимость в модели OPLS-DA или P <0,05, U-критерий Манна-Уитни) были обнаружены для 58,5% (71 из 123) предполагаемых метаболитов (рис. 2а, таблица). С1). Из 71 существенно различающихся метаболитов 34 можно было идентифицировать по их масс-спектрам и соответствующему индексу удерживания, тогда как 37 были отнесены только к возможному классу соединений или остались неидентифицированными. Чтобы подтвердить обнаруженные метаболические признаки в костной метастатической ткани и исследовать, существует ли уникальный образец метаболитов для РПЖ, в отдельном цикле был профилирован набор дополнительных образцов.Этот «тестовый набор» включал образцы костных метастазов аденокарцином предстательной железы (6), молочной железы (3), почек (2) и плоскоклеточных клеток (2), а также нормальные образцы костей от соответствующих пациентов, подготовленных, профилированных и спрогнозированных как отдельная когорта проверки. (Таблица 1). Прогнозирование метастазов РПЖ в кости и соответствующих образцов нормальной кости (вслепую для модели) в модели OPLS-DA выявило четкое различие между классами образцов в тестовом наборе (рис. 2c). Кроме того, отдельная модель OPLS-DA дала достоверную разницу ( P <0.001) между костными метастазами РПЖ и соответствующими образцами нормальной кости в тестовом наборе, а метаболиты, значительно разделяющие эти группы образцов (таблица S2), в значительной степени перекрываются со значительными метаболитами, обнаруженными в модельном наборе (таблица S1). Кроме того, OPLS-DA выявило очевидное и значительное (P<0,005) разделение между метастазами РПЖ в кости и метастазами других видов рака (рис. S1).
Рисунок 1. Классификация метаболитов.
Идентифицированные метаболиты классифицируются в соответствии с химическим классом, и указывается количество метаболитов в каждом классе, значительно связанных с метастазированием ( P <0.05, U-критерий Манна-Уитни или VIP>0,9). Классификация метаболитов по химическому классу (база данных метаболомов человека; www.hmdb.ca). n = количество идентифицированных метаболитов в каждом классе метаболитов.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014175.g001
Рисунок 2. Метаболическая сигнатура метастазов рака предстательной железы в кости.
A ) Корреляционные нагрузки (p[1]) из анализа OPLS-DA значительно различающихся метаболитов ( P <0.05, U-критерий Манна-Уитни или VIP>0,9) между метастазами рака предстательной железы в кости и нормальной костью, показывая положительные значения для метаболитов с повышенными уровнями в метастазах в кости и отрицательные значения для метаболитов со сниженными уровнями в метастазах в кости. Классификация неидентифицированных соединений в соответствии с химическим классом (база данных метаболома человека; www.hmdb.ca) B ) График оценки OPLS-DA, показывающий статистически значимое разделение ( P <0,001) между нормальными метастазами в кости и раком предстательной железы. C ) Тестовый набор прогнозов метастазов рака предстательной железы в кости и соответствующих нормальных образцов костей (вслепую для модели) в модель OPLS-DA, показывающий четкое различие между классами образцов на основе обнаруженных метаболических признаков.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014175.g002
Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов, оперированных по поводу осложнений костных метастазов и включенных в модель и набор тестов ГХ-МС анализа костных метастазов и соответствующих нормальных образцы костей.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014175.t001
Среди обнаруженных метаболитов в костных метастазах РПЖ (рис. 2а и таблица S1) мы обнаружили повышенные уровни некоторых аминокислот по сравнению с нормальной костью, что указывает на высокую метаболизм аминокислот. Следовательно, все 12 основных канонических путей при метастазах РПЖ, предложенных системным анализом путей (Ingenuity Systems, Inc.), были связаны с синтезом и метаболизмом аминокислот (таблица S3). Метаболизм аминокислот также был главной функцией, указанной в анализе пути Ingenuity для метастазов РПЖ в кости (таблица S4).Кроме того, мы обнаружили высокие уровни холестерина, мио-инозитол-1-фосфата, лимонной кислоты, фумарата, глицерин-3-фосфата и жирных кислот (таблица S1), которые связаны с молекулярными и клеточными функциями в костных метастазах РПЖ, как указано. в таблице S4.
Мы особо отметили высокий уровень холестерина в костных метастазах РПЖ, поскольку холестерин показал самое высокое значение VIP при дифференциации костных метастазов РПЖ от нормальной костной ткани (таблица S1, рисунок 2a), а также от других метастазов в кости (таблица S5).Более того, было высказано предположение, что холестерин способствует развитию и прогрессированию рака (обзор в [17]), и поэтому он был выбран для дальнейшего анализа. Высокий уровень холестерина в костных метастазах РПЖ по сравнению с нормальной костью ( P = 3,12E-5, рис. 3a) был четко подтвержден в данных тестовой выборки ( P = 0,001, рис. 3b). Интересно, что уровни холестерина в костных метастазах РПЖ также были высокими по сравнению с уровнями в костных метастазах других видов рака (P = 0,0002, рисунок 3b).
Рисунок 3. Уровни холестерина и экспрессия ферментов для притока и синтеза холестерина.
A. Коробчатая диаграмма концентрации холестерина (мг холестерина/г ткани), показывающая значительно более высокие уровни при метастазах рака предстательной железы (РПЖ) в кости по сравнению с нормальной костью. B. Коробчатая диаграмма концентрации холестерина (мг холестерина/г ткани) в тестовом наборе, показывающая значительно более высокие уровни метастазов РПЖ в кости по сравнению с нормальной костью, а также по сравнению с метастазами в кости других видов рака; рак молочной железы, почки и плоскоклеточный рак (BCa, KCa и SCa). н.э. Иммуногистохимическое окрашивание рецепторов липопротеинов низкой плотности (LDL-R), рецепторов-мусорщиков класса B типа 1 (SR-B1) и редуктазы 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермента А (HMG-CoA red.) при РПЖ костные метастазы, демонстрирующие интенсивное окрашивание и указывающие на возможность притока, а также de novo синтеза холестерина в опухолевых эпителиальных клетках, как предполагается в F. F. Приток и синтез холестерина стимулируется действием рецептора андрогенов (AR) частично посредством активации белка, связывающего регуляторный элемент стерола (SREBP), и последующей транскрипции LDL-R и HMG-CoA red [24], [25], а андрогены могут быть получены из холестерина путем его преобразования в несколько этапов [27], [28]. .
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014175.g003
Метастазы рака предстательной железы в кости обладают механизмом поглощения и синтеза холестерина
de novoХолестерин представляет собой потенциальную терапевтическую мишень, и поэтому мы хотели изучить возможные причины высокого уровня холестерина в костных метастазах РПЖ. Клетки могут получать холестерин за счет экзогенного притока через рецептор липопротеинов низкой плотности (LDL-R), рецептор-мусорщик класса B типа 1 (SR-B1) или путем синтеза de novo из ацетил-КоА, где восстановление 3-гидрокси- Превращение 3-метилглутарил-кофермента А (ГМГ-КоА) в мевалонат считается лимитирующей стадией [18], [19].Таким образом, залитые в парафин кусочки метастазов РПЖ, включенные в анализ GC/TOFMS, были иммуноокрашены на LDL-R, SR-B1 и HMG-CoA-редуктазу. Во всех случаях РПЖ наблюдалось сильное гомогенное окрашивание метастатических эпителиальных клеток ЛНП-Р и иногда менее интенсивное окрашивание соседних клеток стромы, эндотелиальных клеток, адипоцитов и костных клеток (рис. 3с, таблица 2). Эпителиальное окрашивание редуктазы SR-B1 и HMG-CoA было более неоднородным, от слабого до интенсивного (таблица 2). Интересно, что HMG-CoA-редуктаза показала особенно интенсивное окрашивание в эндотелиальных клетках, стенках сосудов, иммунных клетках и костных клетках (рис. 3e), в то время как SR-B1 показала отрицательное окрашивание стромы (рис. 3d).Наши результаты показывают, что опухолевые эпителиальные клетки в костных метастазах РПЖ, возможно, синтезируют холестерин de novo через ГМГ-КоА-редуктазу, но также и другие типы клеток в микроокружении костных метастазов экспрессируют этот фермент, что, возможно, позволяет им обеспечивать холестерин, который можно было бы принять. вверх опухолевыми эпителиальными клетками через рецепторы ЛПНП и SRB-1 (рис. 3f). Не было очевидной связи между гетерогенностью иммуноокрашивания SR-B1 и HMG-CoA и соответствующими уровнями холестерина в костных метастазах РПЖ (данные не показаны).Интересно, однако, что костные метастазы РПЖ в целом демонстрировали более сильное иммунное окрашивание LDL-R и SR-B1, чем костные метастазы различного происхождения (таблица 2), что, возможно, способствовало относительно более высоким уровням холестерина, наблюдаемым в метастазах РПЖ (рис. 3). .
Метаболические различия между тканями первичной опухоли предстательной железы у пациентов с высоким риском с установленными костными метастазами и без них
Первичная ткань РПЖ, полученная от пациентов с опухолями высокого риска (определяемыми как местно-распространенный или низкодифференцированный рак; стадии T3-4 и/или GS 8-10) с (M1, n = 7) или без (M0, n = 6) ) диагностированные метастазы в кости были профилированы по сравнению с доброкачественными образцами предстательной железы (n = 17, таблица 3).В результате было получено 157 предполагаемых пиков метаболитов, 59 из которых можно было идентифицировать (рис. 1). Четкая и статистически значимая дискриминация (P<0,001), определенная с помощью ANOVA модели с перекрестной проверкой, между всеми тремя классами тканей предстательной железы (доброкачественная, M0 и M1) была выявлена с помощью моделирования OPLS-DA (рис. S2). Значительные изменения, связанные с метастатическим заболеванием, определяемые как изменения метаболитов M1 по сравнению с доброкачественными и M1 по сравнению с M0 (P<0,05 или VIP>0,9), были обнаружены для 13 метаболитов, восемь из которых были идентифицированы (таблицы S6 и S7).Интересно, что четыре из них также были значительно увеличены в образцах костных метастазов по сравнению с нормальной костью; аспаргин, треонин, фумаровая кислота и линолевая кислота (таблица S1).
Различение профилей метаболитов в плазме крови у пациентов с опухолями высокого риска с установленными метастазами в кости и без них
Исследование метаболома плазмы больных РПЖ с (M1, n = 15) и без (M0, n = 13) диагностированными костными метастазами и мужчин с доброкачественным заболеванием было основано на 179 разрешенных предполагаемых метаболитах, и из этих 50 можно было назначить личность (рис. 1).Несмотря на явное перекрытие уровней ПСА в сыворотке (таблица 3), с использованием моделирования OPLS-DA было получено значительное разделение (P<0,003) для различий между M1 и доброкачественной плазмой, а также между M1 и M0 плазмой, определенной с помощью ANOVA модели с перекрестной проверкой. Двадцать семь метаболитов, семь идентифицированных, были обнаружены как значительно измененные (P<0,05 или VIP>0,9) в плазме крови пациентов с M1 по сравнению с пациентами с доброкачественным заболеванием (таблица S8) и заболеванием M0 (таблица S9). Интересно, что из этих 27 четыре метаболита; глутаминовая кислота, таурин и фенилаланин (повышены в крови) и стеариновая кислота (снижены в крови) также были обнаружены в качестве маркеров метастазирования в кости (таблица S1).Сводка всех идентифицированных метаболитов в различных типах образцов представлена в таблице S10, а данные можно найти в вспомогательном файле данных (данные S1).
Уровни саркозина в образцах тканей и плазмы
Уровни саркозина измеряли отдельно в образцах с использованием дериватизации AccQ•Tag с последующим анализом ЖХ/МС. Анализ показал увеличение содержания саркозина в костных метастазах РПЖ по сравнению с нормальной костью, в то время как не наблюдалось никакой разницы по сравнению с костными метастазами других видов рака (рис. S3).Кроме того, при сравнении уровней саркозина в доброкачественной ткани предстательной железы и ткани первичной опухоли предстательной железы не наблюдалось явного прогрессирования заболевания, хотя небольшое количество (n = 5) экстрактов первичной опухоли, доступных для этого анализа, повлияло на надежность результатов, а также сделал сравнение между первичной опухолью и костными метастазами ненадежным. Сравнение уровней саркозина в плазме крови не выявило существенных различий, связанных с РПЖ или наличием костных метастазов (данные не представлены).
Обсуждение
Здесь мы впервые сообщаем о всестороннем анализе метаболических паттернов метастазов РПЖ в кости по сравнению с первичным РПЖ, доброкачественной тканью предстательной железы и нормальной костной тканью. Нами обнаружены метаболиты, которые отличают костные метастазы РПЖ от нормальных образцов кости и, кроме того, от костных метастазов различного происхождения. Мы также обнаружили метаболиты, которые, в отличие от ПСА, показали измененные уровни в плазме и первичной опухоли у лиц с метастатическим РПЖ по сравнению с пациентами с опухолями высокого риска, но без обнаруживаемых метастазов.Одним из наших наиболее заметных результатов является высокий уровень холестерина в костных метастазах РПЖ, который, вероятно, достигается за счет синтеза холестерина de novo в опухолевых эпителиальных клетках, а также притока этого метаболита из окружающей среды через LDL-R и SR-. Б1.
Повышенная биодоступность холестерина в опухолевых клетках может иметь большое биологическое значение для роста метастазов в кости, поскольку было показано, что добавление холестерина увеличивает пролиферацию, миграцию и инвазию опухолевых клеток РПЖ in vitro [20], в то время как нацеливание холестерина индуцирует апоптоз [21] , вероятно, за счет снижения содержания холестерина в липидном рафте и, таким образом, вмешательства в передачу сигналов фактора роста [21], [22].Предстательная железа обычно содержит высокий уровень холестерина по сравнению с другими органами, и ранее повышенный уровень холестерина был связан с РПЖ [23]. Дальнейшее повышение уровня холестерина в костных метастазах, очевидно, может отражать высокую потребность в биосинтезе мембран в пролиферирующих клетках, а также тот факт, что метаболизм холестерина напрямую регулируется андрогенами (обзор в [24]). Андрогены положительно регулируют транскрипцию гена LDL-R, а также способствуют синтезу холестерина за счет увеличения транскрипции HMG-CoA-редуктазы [25] и, таким образом, ограничивающего скорость превращения HMG-CoA в мевалонат [26].Поскольку андрогенные рецепторы экспрессируются и предположительно активны в большинстве костных метастазов при КРРПЖ [14], действие андрогенов, вероятно, способствует более высокому уровню холестерина в метастазах РПЖ по сравнению с костными метастазами различного происхождения. Холестерин, в свою очередь, возможно, способствует передаче сигналов рецептора андрогена и, таким образом, устойчивому к кастрации росту опухоли у пациентов, получающих андроген-депривационную терапию, путем его превращения в андрогены метаболическими ферментами [27], [28]. Соответственно, западная диета и высокий уровень холестерина в сыворотке были связаны с повышенным риском РПЖ в ряде исследований [29], [30], [31], хотя результаты не были полностью убедительными (обзор в [17]). .Интересно, что недавнее исследование показывает более низкий риск развития РПЖ высокой степени у мужчин с низким уровнем холестерина в сыворотке [32] и, в соответствии с этим, длительное применение ингибиторов ГМГ-КоА-редуктазы («статинов») для профилактики Было показано, что сердечно-сосудистые заболевания снижают риск прогрессирования РПЖ в агрессивное, фатальное заболевание [33], [34], [35], [36]. Также было показано, что агенты, снижающие уровень холестерина, ингибируют рост клеток РПЖ in vitro и в модельных экспериментальных системах in vivo [37], [38].В совокупности эти результаты указывают на возможность использования ингибиторов холестерина в качестве средств для лечения или химиопрофилактики метастазов РПЖ, но в этом случае необходимы новые препараты, поскольку статины, используемые сегодня, в основном концентрируются в печени и плохо достигают периферических органов [17].
Мы обнаружили высокие уровни многих аминокислот в костных метастазах РПЖ, а метаболизм аминокислот был наиболее измененным функциональным путем, связанным с костными метастазами РПЖ, согласно анализу пути Ingenuity.Таким образом, наши результаты подтверждают исследование, основанное на метаболизме, проведенное Шрикумаром и его сотрудниками [9], а также более ранние исследования, основанные на экспрессии генов, показывающие увеличение синтеза белка во время прогрессирования РПЖ [39]. Интересно, что в недавней статье подчеркивается, что уровни аминоацил-тРНК-синтетаз (aaRS) также увеличиваются во время прогрессирования РПЖ и, кроме того, что транскрипция некоторых aaRS стимулируется андрогенами [40]. Это замечательное открытие, возможно, может быть связано с тем, что мы обнаружили повышенные уровни некоторых аминокислот, таких как треонин, глутамат, фенилаланин, в костных метастазах РПЖ по сравнению с костными метастазами различного происхождения.В дополнение к аминокислотам, другие известные метаболиты в наших данных (лимонная кислота, фумарат, глицерол-3-фосфат и жирные кислоты) указывают на высокий энергетический метаболизм, который может отражать высокую долю пролиферирующих клеток в костных метастазах [14]. Более того, высокие уровни мио-инозитол-1-фосфата могут быть признаком активной передачи сигналов клетками с участием молекул на основе инозитола в качестве вторичных мессенджеров, таких как инозитолфосфаты и фосфатидилинозитолфосфаты. Эти молекулы участвуют в активации протеинкиназы С и Akt и, таким образом, в регуляции процессов, считающихся отличительными признаками рака, т.е.е. клеточная пролиферация, апоптоз, дифференцировка, инвазия и ангиогенез [41]. В целом изменения в метаболоме, обнаруженные в этом исследовании, связанные с метастазами РПЖ в кости, указывают на нарушение молекулярных и клеточных функций, имеющих явное значение для прогрессирования рака. Однако относительную важность этих функций трудно определить, поскольку они частично зависят от классов метаболитов, обнаруживаемых в рамках анализа ГХ/ВПМС, и идентичности, полученной в доступных в настоящее время библиотеках.С помощью метода профилирования метаболитов GC/TOFMS мы не смогли обнаружить саркозин в образцах. Однако, используя подход целевого анализа, мы обнаружили высокие уровни саркозина в костных метастазах в соответствии с предыдущими данными о повышении уровня саркозина при прогрессировании РПЖ [9]. Важно, однако, что мы не видели никакой разницы в уровнях саркозина между метастазами РПЖ в кости и метастазами в кости различного происхождения, что указывает на то, что саркозин не является специфичным для РПЖ, а вместо этого связан с прогрессирующим раком и метастазами.Более полная картина конкретных биологических сетей, важных для роста метастазов РПЖ, будет получена по мере развития методов анализа и более полных библиотек для идентификации, но также может быть достигнута путем объединения метаболомных данных с геномными или протеомными данными. На данный момент мы специально отмечаем, что треонин, аспаргин, фумаровая кислота и линолевая кислота повышены не только в костных метастазах, но и в первичной ткани предстательной железы у пациентов с подтвержденными костными метастазами по сравнению с пациентами с M0.Было показано, что незаменимые жирные кислоты, такие как линолевая кислота, стимулируют рост опухоли РПЖ в модельных системах [42], [43], а превращение линолевой кислоты в арахидоновую кислоту и далее в простагландины может стимулировать воспалительную реакцию, связанную с патогенезом. РПЖ [44].
Однако ни холестерин, ни саркозин не были прогностическими факторами костных метастазов в плазме. Вместо этого высокие уровни глутаминовой кислоты, фенилаланина и таурина были обнаружены в ткани метастазов РПЖ в кости и в плазме мужчин с диагностированными метастазами РПЖ в кости.Недавно в исследовании Срикумара и его коллег было показано, что глутаминовая кислота увеличивается в ткани РПЖ [9], и, что интересно, раковые клетки, вызывающие разрушение костей на животных моделях, выделяют глутамат в окружающую среду [45]. Поскольку глутаматергическая межклеточная коммуникация важна для нормального гомеостаза кости через глутаматные рецепторы на специфических костных клетках (обзор в [46]), возможно, что нарушения в этой системе могут быть обнаружены в процессе костного метастазирования. Наши результаты также согласуются с недавним исследованием, которое обнаружило более высокие уровни таурина в РПЖ, чем в доброкачественных тканях, при оценке с помощью ЯМР-спектроскопии с вращением под магическим углом ((1)H HR-MAS) [47].Однако ценность этих метаболитов как плазменных маркеров агрессивного РПЖ нуждается в подтверждении в дальнейших исследованиях.
В заключение мы определили метаболиты, связанные с метастазированием рака предстательной железы, и особо отметили высокий уровень холестерина в метастазах в кости РПЖ. Основываясь на наших выводах и предыдущей литературе, это делает холестерин возможной терапевтической мишенью для прогрессирующего РПЖ. Хотя это крупнейшее метаболическое исследование костных метастазов РПЖ, оно, безусловно, имеет свои ограничения.Предыдущие исследования 1 H ЯМР выявили очевидные изменения в уровнях цитрата и холина между доброкачественной тканью предстательной железы и опухолевой тканью [5], [6], [7], но мы не смогли обнаружить таких различий в уровнях цитрата. Мы также не могли с помощью нашего метода обнаружить холин. Эти результаты подчеркивают ограничения нашего метода и указывают на необходимость дополнительных подходов в поиске полезных метаболических биомаркеров. Кроме того, довольно небольшое число включенных пациентов и гетерогенность метастатического заболевания делают оценку в дальнейших исследованиях необходимой, прежде чем можно будет гарантировать значимость наших результатов.
Материалы и методы
Заявление об этике
Исследования были одобрены местным комитетом по этике Университета Умео, и участники дали письменное или устное согласие.
Образцы
Костные метастазы и прилежащие нормально выглядящие фрагменты костной ткани были получены из серии свежезамороженных биопсий, взятых у пациентов с диагнозом рака или подозрением на рак, прооперированных по поводу метастатического сдавления спинного мозга или патологических переломов (таблица 1).Пациенты подробно описаны в [14].
Плазма крови была получена от ряда мужчин, которым была проведена трансректальная биопсия предстательной железы под ультразвуковым контролем из-за повышенного уровня ПСА в сыворотке, а в некоторых случаях поддавались оценке первичный РПЖ и биопсия доброкачественной простаты (таблица 3). Все пациенты, включенные в это исследование, были отобраны с опухолями высокого риска, определенными как; наличие костных метастазов или местно-распространенной опухоли или низкодифференцированного рака (М1 и/или Т3-4 и/или GS 8-10), при этом у мужчин с доброкачественным заболеванием было не менее двух раундов отрицательных биопсий.Случаи РПЖ и доброкачественные случаи были сопоставлены в зависимости от времени, прошедшего с момента взятия пробы. Дополнительная информация о пациентах и пробоподготовке приведена в сопроводительном тексте (текст S1).
Метаболомное профилирование с использованием ГХ/ВПМС
Перед анализом ГХ/ВПМС низкомолекулярные метаболиты в образцах плазмы экстрагировали и дериватизировали, как описано ранее [48]. Образцы тканей экстрагировали смесью H 2 O/метанол/хлороформ (1∶3∶1), содержащей 11 внутренних стандартов А [48] (1 мл на 15 мг ткани), равномерно распределенных по всему хроматографическому интервалу удерживания.Экстракцию проводили на бисерной мельнице с двумя вольфрамовыми шариками, а остальная часть процедуры была такой же, как и для образцов плазмы. Затем дериватизированные экстракты образцов вводили в режиме без деления с помощью автоматического пробоотборника CTC Combi Pal (CTC Analytics AG, Цвинген, Швейцария) в газовый хроматограф Agilent 6890, оснащенный 10 м × 0,18 мм внутр. диам. капиллярная колонка из плавленого кварца с химически связанной неподвижной фазой DB 5-MS размером 0,18 мкм (J&W Scientific, Фолсом, Калифорния, США). Выходящий из колонки поток вводили в источник ионов времяпролетного масс-спектрометра Pegasus III, ГХ/ВПМС (Leco Corp., Сент-Джозеф, Мичиган, США). Серия алканов (C10-C40) выполнялась для каждого отдельного цикла ГХ/ВПМС. Более подробную информацию о подготовке проб, дериватизации и анализах ГХ/ВПМС можно найти в дополнительной информации. О воспроизводимости метода сообщалось ранее [16], [48].
Обработка данных
Предварительная обработка данных, включая коррекцию базовой линии, выравнивание хроматограммы, настройку временного окна, разрешение иерархической многомерной кривой (H-MCR) [11] и нормализацию, выполнялась в MATLAB [версия 7.3] с помощью пользовательских скриптов. Более подробную информацию об обработке данных можно найти во вспомогательной информации (текст S1).
Анализ данных и статистика
Ортогональный частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (OPLS-DA) [49] был применен для извлечения и интерпретации систематических вариаций разрешенных профилей тканей и плазмы GC/TOFMS, связанных со специфическими ответами. Цель состояла в том, чтобы выделить метаболические паттерны, связанные с РПЖ и, в частности, с метастатическим заболеванием.Значения важности переменных OPLS-DA в проекции (VIP) в сочетании с одномерными p-значениями (U-критерий Манна-Уитни) использовались для выделения значимых метаболитов или моделей метаболитов (VIP>0,9 или P <0,05). Дисперсионный анализ моделей с перекрестной проверкой использовался для определения значимости извлеченных моделей метаболитов. Сравнения категорийных данных были сделаны с использованием критерия хи-квадрат. Для получения более подробной информации см. вспомогательную информацию (текст S1).
Анализ пути
Дифференциация метаболитов между метастазами РПЖ в кости и нормальной костью (VIP>0.9 в OPLS-DA и/или P <0,05 в U-критерии Манна-Уитни, были включены в анализ путей в соответствии с Ingenuity Systems, Inc. Были перечислены наиболее измененные канонические пути и клеточные и молекулярные функции в костных метастазах.
Идентификация метаболита
Обнаруженные пики были идентифицированы путем поиска в базе данных на основе спектров и хроматографического индекса удерживания с использованием NIST MS-Search v. 2.0 [50] с внутренней базой данных библиотеки масс-спектров, созданной Центром изучения растений Умео (UPSC), библиотека масс-спектров, поддерживаемая Институтом Макса Планка в Голме (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/gmd.html) или библиотеку масс-спектров NIST98. Более подробное описание см. в сопроводительном тексте (текст S1).
Иммуногистохимия
Образцы фиксировали в забуференном формалине, декальцинировали в муравьиной кислоте и заливали в парафин. Залитые парафином срезы толщиной 5 мкм депарафинировали и регидратировали в соответствии со стандартными процедурами и кипятили в 10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА (pH = 9) в течение 1 ч в 2100 Retriever (HistoLab, Frölunda, Швеция). Инкубации первичных антител и вторичных систем были следующими; Рецептор анти-ЛПНП (ab52818, Abcam, Кембридж, Великобритания, разбавленный 1×250) и анти-SRB-1 (EP1556Y, Novus Biologicals, Littleton, CO, разбавленный 1×50) визуализировали с использованием набора для обнаружения DAB iVIEW™ (Ventana , Тусон, Аризона), в то время как анти-HMG-CoA-редуктазу (Upstate, кат. 07-457, Millipore, Temecula, CA, разведенный 1∶250) инкубировали в течение ночи и далее определяли с помощью набора ABC Vectatain (Vector Laboratories, Burlingame, CA ) с DAB в качестве хромогена.Интенсивность окрашивания оценивалась как слабая (+) или интенсивная (++), а для SR-B1 также как отрицательная (-) в нескольких случаях. Положительные контроли для анализов иммуноокрашивания (ткани печени и яичников) показали сильное окрашивание, а контрольные срезы, инкубированные без первичных антител, не показали окрашивания.
Дополнительная информация
Рисунок S1.
Многофакторное моделирование в поисках уникального метаболитного паттерна метастазов рака предстательной железы (РПЖ) в кости. Вектор оценки OPLS-DA (t[1]), показывающий четкую и значительную разницу между метастазами РПЖ в кости и метастазами в кости других видов рака: молочной железы, почки и плоскоклеточного рака (BCa, KCa и SCa).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014175.s012
(2,24 МБ TIF)
Рисунок S2.
Метаболомические различия между тканями первичного рака предстательной железы у пациентов с высоким риском с (M1) и без (M0) установленных метастазов в кости. График оценки OPLS-DA (t[2]/t[1]), показывающий четкие различия в метаболических сигнатурах в ткани первичной опухоли предстательной железы у пациентов с диагностированными метастазами в кости и без них по сравнению с доброкачественной тканью предстательной железы.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014175.s013
(2,40 МБ TIF)
Рисунок S3.
Уровни саркозина в костных метастазах. А. Коробчатая диаграмма для концентрации саркозина, показывающая значительно более высокие уровни при метастазах рака предстательной железы (РПЖ) в кости по сравнению с нормальной костью. B. Коробчатая диаграмма для саркозина в тестовом наборе, показывающая более высокие уровни метастазов РПЖ в кости по сравнению с нормальной костью, но отсутствие различий в уровнях метастазов РПЖ в кости по сравнению с метастазами в кости других видов рака; рак молочной железы, почки и плоскоклеточный рак (BCa, KCa и SCa).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014175.s014
(4,93 МБ TIF)
Благодарности
Авторы выражают благодарность Pernilla Andersson, Elisabeth Dahlberg, Birgitta Ekblom, Inger Lindström, Krister Lundgren и Åsa Skytt за квалифицированную техническую помощь.
Авторские взносы
Задумал и разработал эксперименты: HA PW. Проведены эксперименты: ЭТ ИС ПВ. Проанализированы данные: ET EH. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: SC AW AIJ PS AB TM.Написал статью: ET HA PW. Внес вклад в клиническую экспертизу: SC AW PS. Содействовала гистологической и патологоанатомической экспертизе: А.Б. Внес методологическую экспертизу: TM.
Каталожные номера
- 1. Catalona WJ, Partin AW, Slawin KM, Brawer MK, Flanigan RC, et al. (1998)Использование процентного содержания свободного простатспецифического антигена для усиления дифференциации рака предстательной железы от доброкачественного заболевания предстательной железы: проспективное многоцентровое клиническое исследование. ДЖАМА 279: 1542–1547.
- 2.Klotz L (2006)Активное наблюдение по сравнению с радикальным лечением локализованного рака предстательной железы с благоприятным риском. Curr Treat Options Oncol 7: 355–362.
- 3. Lopergolo A, Zaffaroni N (2009)Биомолекулярные маркеры прогнозирования исхода рака предстательной железы. Рак 115: 3058–3067.
- 4. Parekh DJ, Ankerst DP, Troyer D, Srivastava S, Thompson IM (2007)Биомаркеры для обнаружения рака предстательной железы. Дж. Урол 178: 2252–2259.
- 5. Фаулер А.Х., Паппас А.А., Холдер Дж.К., Финкбайнер А.Е., Далримпл Г.В. и соавт.(1992) Дифференциация рака предстательной железы человека от доброкачественной гипертрофии с помощью 1H ЯМР in vitro. Magn Reson Med 25: 140–147.
- 6. Курханевич Дж., Дахия Р., Макдональд Дж. М., Чанг Л. Х., Джеймс Т. Л. и другие. (1993) Цитратные изменения в первичных и метастатических аденокарциномах предстательной железы человека: 1H магнитно-резонансная спектроскопия и биохимическое исследование. Magn Reson Med 29: 149–157.
- 7. Корнел Э.Б., Смитс Г.А., Остерхоф Г.О., Картхаус Х.Ф., Дебурайн Ф.М. и др. (1993) Характеристика рака предстательной железы человека, доброкачественной гиперплазии предстательной железы и нормальной предстательной железы с помощью магнитно-резонансной спектроскопии 1H и 31P in vitro.Дж Урол 150: 2019–2024.
- 8. Zakian KL, Shukla-Dave A, Ackerstaff E, Hricak H, Koutcher JA (2008) 1H магнитно-резонансная спектроскопия рака предстательной железы: биомаркеры для характеристики опухоли. Раковая биомарка 4: 263–276.
- 9. Шрикумар А., Пуассон Л.М., Раджендиран Т.М., Хан А.П., Цао К. и др. (2009) Метаболические профили определяют потенциальную роль саркозина в прогрессировании рака предстательной железы. Природа 457: 910–914.
- 10. Chan EC, Koh PK, Mal M, Cheah PY, Eu KW и др.(2009) Метаболическое профилирование колоректального рака человека с использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса с вращением под магическим углом (HR-MAS ЯМР) высокого разрешения и масс-спектрометрии с газовой хроматографией (ГХ / МС). J Proteome Res 8: 352–361.
- 11. Денкерт С., Будчиес Дж., Кинд Т., Вейхерт В., Таблэк П. и др. (2006) Метаболическое профилирование на основе масс-спектрометрии выявляет различные модели метаболитов в инвазивных карциномах яичников и пограничных опухолях яичников. Рак Рез. 66: 10795–10804.
- 12. Denkert C, Budcies J, Weichert W, Wohlgemuth G, Scholz M, et al. (2008) Метаболитный профиль карциномы толстой кишки человека – нарушение регуляции цикла ТСА и оборота аминокислот. Мол Рак 7:72.
- 13. Issaq HJ, Nativ O, Waybright T, Luke B, Veenstra TD, et al. (2008)Обнаружение рака мочевого пузыря в моче человека путем метаболомного профилирования с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии. Дж. Урол 179: 2422–2426.
- 14. Crnalic S, Hörnber E, Wikström P, Lerner UH, Tieva Å, Svensson O, Widmark A, Bergh A (2010) Окрашивание ядерных рецепторов андрогенов в метастазах в кости связано с плохим исходом у пациентов с раком простаты.Рак, связанный с эндокринной системой.
- 15. Йонссон П., Йоханссон Э.С., Вуоликайнен А., Линдберг Дж., Шуппе-Койстинен И. и соавт. (2006)Прогностическое профилирование метаболитов с применением разрешения иерархической многомерной кривой к данным ГХ-МС – потенциальный инструмент для многопараметрической диагностики. J Proteome Res 5: 1407–1414.
- 16. Йонссон П., Йоханссон А.И., Гуллберг Дж., Тригг Дж., А.Дж. и др. (2005)Высокопроизводительный анализ данных для обнаружения и выявления различий между образцами в метаболомных анализах на основе ГХ/МС.Аналитическая химия 77: 5635–5642.
- 17. Соломон К.Р., Фриман М.Р. (2008) Влияют ли снижающие уровень холестерина свойства статинов на риск развития рака? Тенденции Endocrinol Metab 19: 113–121.
- 18. Браун М.С., Гольдштейн Дж.Л. (1986)Опосредованный рецептором путь гомеостаза холестерина. Наука 232: 34–47.
- 19. Райндс Д., Бриссет Л. (2004)Роль рецепторов-мусорщиков класса B типа I (SR-BI) в транспортировке липидов. определение правил для трейдеров липидов.Int J Biochem Cell Biol 36: 39–77.
- 20. Awad AB, Fink CS, Williams H, Kim U (2001)Влияние фитостеролов in vitro и in vivo (мыши SCID) на рост и распространение клеток рака предстательной железы человека PC-3. Eur J Рак Предыдущая 10: 507–513.
- 21. Zhuang L, Kim J, Adam RM, Solomon KR, Freeman MR (2005)Нацеливание на холестерин изменяет состав липидного рафта и выживаемость клеток в клетках рака предстательной железы и ксенотрансплантатах. Дж. Клин Инвест 115: 959–968.
- 22.Zhuang L, Lin J, Lu ML, Solomon KR, Freeman MR (2002)Богатые холестерином липидные плоты опосредуют регулируемое akt выживание в клетках рака предстательной железы. Рак Рез. 62: 2227–2231.
- 23. Schaffner CP (1981)Метаболизм холестерина предстательной железы: регуляция и изменение. Prog Clin Biol Res 75A: 279–324.
- 24. Heemers HV, Verhoeven G, Swinnen JV (2006)Андрогенная активация пути белка, связывающего регуляторный элемент стерола: текущее понимание. Мол Эндокринол 20: 2265–2277.
- 25. Хортон Д.Д., Шах Н.А., Уоррингтон Д.А., Андерсон Н.Н., Парк С.В. и др. (2003) Комбинированный анализ данных микрочипов олигонуклеотидов от трансгенных и нокаутных мышей идентифицирует прямые гены-мишени SREBP. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 12027–12032.
- 26. Soccio RE, Breslow JL (2004) Внутриклеточный транспорт холестерина. Arterioscler Thromb Vasc Biol 24: 1150–1160.
- 27. Dillard PR, Lin MF, Khan SA (2008)Андроген-независимые клетки рака предстательной железы приобретают полный стероидогенный потенциал синтеза тестостерона из холестерина.Mol Cell Endocrinol 295: 115–120.
- 28. Монтгомери Р.Б., Мостагель Э.А., Весселла Р., Хесс Д.Л., Калхорн Т.Ф. и соавт. (2008)Поддержание внутриопухолевых андрогенов при метастатическом раке предстательной железы: механизм устойчивого к кастрации роста опухоли. Рак Рез. 68: 4447–4454.
- 29. Брави Ф., Бозетти С., Даль Масо Л., Таламини Р., Монтелла М. и др. (2006)Макроэлементы, жирные кислоты, холестерин и риск доброкачественной гиперплазии предстательной железы. Урология 67: 1205–1211.
- 30.Кук Л.С., Голдофт М., Шварц С.М., Вайс Н.С. (1999)Заболеваемость аденокарциномой простаты у азиатских иммигрантов в США и их потомков. Дж. Урол 161: 152–155.
- 31. Магура Л., Бланшар Р., Хоуп Б., Бил Дж. Р., Шварц Г. Г. и др. (2008)Гиперхолестеринемия и рак предстательной железы: исследование случай-контроль в больнице. Рак вызывает контроль 19: 1259–1266.
- 32. Platz EA, Till C, Goodman PJ, Parnes HL, Figg WD, et al. (2009) Мужчины с низким уровнем холестерина в сыворотке имеют более низкий риск развития рака простаты высокой степени злокачественности в группе плацебо в исследовании по профилактике рака простаты.Рак эпидемиол биомаркеры Prev 18: 2807-2813.
- 33. Флик Э.Д., Хабель Л.А., Чан К.А., Ван Ден Иден С.К., Куинн В.П. и др. (2007) Использование статинов и риск рака простаты в когорте Калифорнийского исследования мужского здоровья. Рак эпидемиол биомаркеры Prev 16: 2218-2225.
- 34. Jacobs EJ, Rodriguez C, Bain EB, Wang Y, Thun MJ и др. (2007)Лекарства, снижающие уровень холестерина, и распространенность рака предстательной железы в большой когорте в США. Рак эпидемиол биомаркеры Prev 16: 2213-2217.
- 35. Murtola TJ, Tammela TL, Lahtela J, Auvinen A (2007)Лекарства, снижающие уровень холестерина, и риск рака предстательной железы: популяционное исследование случай-контроль. Биомаркеры эпидемиола рака Предыдущая 16: 2226–2232.
- 36. Platz EA, Leitzmann MF, Visvanathan K, Rimm EB, Stampfer MJ, et al. (2006)Статиновые препараты и риск прогрессирующего рака предстательной железы. J Natl Cancer Inst 98: 1819–1825.
- 37. Sivaprasad U, Abbas T, Dutta A (2006)Дифференциальная эффективность ингибиторов 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА-редуктазы в клеточном цикле клеток рака предстательной железы.Мол Рак Тер 5: 2310–2316.
- 38. Соломон К.Р., Пелтон К., Буше К., Джу Дж., Талли С. и др. (2009)Эзетимиб является ингибитором опухолевого ангиогенеза. Ам Дж. Патол 174: 1017–1026.
- 39. Tomlins SA, Mehra R, Rhodes DR, Cao X, Wang L, et al. (2007)Интегративное молекулярное концептуальное моделирование прогрессирования рака предстательной железы. Нат Жене 39: 41–51.
- 40. Веллаичами А., Шрикумар А., Стралер Дж. Р., Раджендиран Т., Ю Дж. и др. (2009)Исследование протеомного действия андрогенов в клетках рака предстательной железы выявило роль аминоацил-тРНК-синтетаз.PLoS One 4: e7075.
- 41. Али А.С., Али С., Эль-Райес Б.Ф., Филип П.А., Саркар Ф.Х. (2009)Использование протеинкиназы С: полезная мишень для лечения рака. Лечение рака Откр. 35: 1–8.
- 42. Cesano A, Visonneau S, Scimeca JA, Kritchevsky D, Santoli D (1998) Противоположные эффекты линолевой кислоты и конъюгированной линолевой кислоты на рак предстательной железы человека у мышей SCID. Противораковые рез. 18: 1429–1434.
- 43. Connolly JM, Rose DP (1992)Взаимодействия между аутокринной регуляцией, опосредованной эпидермальным фактором роста, и стимулированным линолевой кислотой ростом клеточной линии рака предстательной железы человека.Простата 20: 151–158.
- 44. Де Марзо А.М., Платц Э.А., Сатклифф С., Сюй Дж., Гронберг Х. и др. (2007)Воспаление при канцерогенезе предстательной железы. Nat Rev Рак 7: 256–269.
- 45. Seidlitz EP, Sharma MK, Saikali Z, Ghert M, Singh G (2009)Линии раковых клеток выделяют глутамат во внеклеточную среду. Clin Exp Metastasis 26: 781–787.
- 46. Takarada T, Yoneda Y (2008)Фармакологические аспекты костного метаболизма: глутамат как сигнальный медиатор в костях.J Pharmacol Sci 106: 536–541.
- 47. Суонсон М.Г., Виньерон Д.Б., Табатабай З.Л., Малес Р.Г., Шмитт Л. и соавт. (2003)Протонная HR-MAS-спектроскопия и количественный патологический анализ послеоперационных тканей предстательной железы, нацеленных на МРТ/3D-MRSI. Magn Reson Med 50: 944–954.
- 48. A J, Trygg J, Gullberg J, Johansson AI, Jonsson P, et al. (2005)Извлечение и ГХ/МС анализ метаболома плазмы крови человека. Анальная химия 77: 8086–8094.
- 49. Bylesjo M, Rantalainen M, Cloarec O, Nicholson JK, Holmes E, et al.