Кутикула на ногах: Как правильно сделать педикюр в домашних условиях?

Кутикула на ногах: Как правильно сделать педикюр в домашних условиях?

04.04.1993

Содержание

Как правильно сделать педикюр в домашних условиях?

Можно добавить растительное либо оливковое масла, сделать различные ванночки, рецепты которых вы найдете ниже. Но не следует забывать — горячие ванночки нельзя делать при варикозном расширении вен. В этом случае помочь подготовить ноги к педикюру помогут ванночки с более низкой температурой воды и с теми же добавками. По мере остывания воды нужно добавлять горячую. Как только вы ощутите, что кожа на ногах хорошо распарилась, можно приступать к обработке.

Куском мелкозернистой пемзы или нежесткой щеткой полезно потереть подошвы и пятки круговыми движениями, или воспользоваться очищающим пилингом для ног. После удаления омертвевших частичек сполоснуть ноги водой и через 25 — 30 минут можно приступать к педикюру. Желательно перед процедурой сделать массаж.

Обрезной педикюр

Этот вид педикюра известен уже более 100 лет, его еще называют классическим. Сначала ноги необходимо распарить в теплой ванночке, о которой говорилось выше, а ногти подстричь ножницами (чтобы края оставались прямыми, а не закругленными) и обработать пилочкой. Не советуется использовать железную пилочку, так как она повреждает структуру ногтя. Затем на кожу вокруг ногтя (кутикулу) нужно нанести смягчающий крем.

Специальной лопаточкой кутикулу надо отодвинуть к основанию ногтя и обрезать щипчиками или маникюрными ножницами. По окончании кожу вокруг ногтя полезно будет смазать укрепляющим маслом, которое препятствует образованию заусенцев. И в заключение можно наносить основу и лак.

Самое сложное при обрезном педикюре — это удаление кутикулы. При небрежном или торопливом выполнении этой процедуры очень велика вероятность образования заусенцев и порезов. Кстати, если вы обрежете кожу вокруг ногтя слишком сильно, задевая кровеносные сосуды, кутикула начнет расти еще быстрее и станет плотнее.

Безопасный педикюр

Его еще называют европейским, или сухим. Он отличается от классического тем, что кожа вокруг ногтя не обрезается, а удаляется при помощи специальных кремов. Сначала на кутикулу надо нанести специальный смягчающий состав и аккуратно отодвинуть ее лопаточкой к основанию (желательно использовать деревянную лопаточку или ватную палочку). После этого можно полировать ногти и наносить лак. Перед безопасным педикюром ноги не следует распаривать. Так что если вам необходимо удалить ороговевший налет со стоп, то лучше сделать это заранее.

Основная трудность заключается в том, что безопасный педикюр после первой процедуры выглядит непривлекательно. Это связано с тем, что кутикула сразу полностью не удаляется, а размягчается постепенно. Только через 8 — 10 сеансов ваши ногти станут действительно идеальными.

Этот вид педикюра легко осуществлять в домашних условиях, необходимо только приобрести набор специальных масел и кремов для удаления и размягчения кутикулы. Сухой педикюр рекомендуется людям с близко расположенными к поверхности кожи кровеносными сосудами и плотной кутикулой: в этом случае при обрезном педикюре нельзя избежать порезов. Также безопасный способ более гигиеничен. И самое главное — кутикула значительно замедляет свой рост.


Ноготь большого пальца при любом виде педикюра надо обрезать только по прямой линии, чтобы не допускать его врастания в окружающую кожу.

Это очень неприятное, доставляющее неудобство и боль явление, избавиться от которого очень сложно даже с помощью опытного мастера педикюра.

Если же вас настигла эта проблема, то справится с ней практически безболезненно можно с помощью раствора йоксуна, который можно приобрести в аптеке или в косметическом салоне. Для этого не забывайте смазывать им боковые лунки большого пальца несколько раз в сутки.

Также есть другой, не менее хороший способ. Необходимо взять в равных пропорциях глицерин и уксусную эссенцию, смешать и закапывать в лунки большого пальца каждый день в течение месяца.

Перед педикюром советую также обратить внимание на состояние ваших ногтей. Ведь заявление, что самый красивый и дорогой лак будет плохо смотреться на больных или неухоженных ногтях всегда было справедливо. Ухаживать за ними несложно, но делать это надо регулярно. Различные загрязнения и омертвевшие клетки, рекомендуется удалять из-под ногтей тупой костяной или деревянной палочкой, но следует быть осторожной, чтобы не повредить внутреннюю поверхность ногтя. При полировке ногтевой пластины применяется специальная пилочка, не повреждающая ногтевой покров и препятствующая образованию трещин и расслаиваний.

Не следует забывать, что уход за стопами и педикюр — обязательная процедура не только летом, когда наши ноги открыты и находятся все время на виду, но и зимой. В холодное время года, когда кожа не может дышать из-за тяжелой обуви и теплых колготок или носков, тщательный уход ногам просто необходим.

Как правильно делать педикюр

 

Для того, чтобы ножки всегда выглядели соблазнительно в открытой обуви, не обязательно посещать салон красоты. Аккуратный, модный педикюр можно выполнить самостоятельно в домашних условиях, при минимальных затратах времени. Техника педикюра достаточна проста, и мы готовы поделиться с вами некоторыми секретами как сделать педикюр дома, чтобы ваши пальчики выглядели безупречно, а кожа на пятках была нежной и гладкой.

Как часто делать педикюр? Специалисты советуют делать педикюр один раз в 8-10 дней. При регулярном уходе за своими ножками кожа на ступнях станет как у младенца, а ногти будут выглядеть аккуратно.

Перед педикюром необходимо хорошо вымыть ноги и удалить старый лак. Возьмите набор для педикюра и продезинфецируйте все инструменты.

Теперь приступаем к основному этапу процедуры.

 

Распариваем ноги

 

Для начала кожу ног необходимо размягчить. Приготовьте ванночку для педикюра с теплой водой, добавьте в нее мыльную пену (это может быть гель для душа или шампунь). Для усиления эффекта полезно добавить также в ванночку немного морской соли. Опустите ноги в воду на 5-15 минут, чтобы омертвевшие сухие клеточки кожи размякли. Теперь вытираем ноги полотенцем и переходим к следующему, самому ответственному этапу педикюра.

 

Обрабатываем ногти и кутикулу

 

Чтобы сделать правильный педикюр, возьмите маникюрные ножницы или кусачки, срежьте выступающую часть ногтя по прямой линии. Форма ногтей на ногах должна быть квадратной, чтобы предотвратить врастание ногтя в кожу.

С помощью пилочки для ногтей подровняйте срез и шершавые кончики ногтя по направлению от краев к центру.

С помощью маникюрной лопаточки или апельсиновой палочки аккуратно отодвиньте кутикулу. Чтобы облегчить выполнение педикюра можно на кутикулу нанести специальный препарат, который размягчает и удаляет лишнюю кожу, затем через 5 минут снять остатки. С помощью лопаточки постарайтесь очистить ногтевую пластину от прилипших частиц кутикулы. Проведите палочкой под ногтем, чтобы почистить скопившуюся там грязь и сухие клетки кожи.

Теперь пилочкой для ногтей можно очистить кончики пальцев от загрубевшей сухой кожи, а также удалить потрескавшуюся кожу на мозолях.

Чтобы ногтевая пластина выглядела гладкой и блестящей, ее нужно отполировать с помощью двухсторонней пилки для педикюра. Темно-синей стороной пилочки аккуратно проведите по ногтям со всех сторон, особенно в области кутикул. На идеально гладких ногтях лак будет держаться намного дольше.

 

Педикюр на дому.

Уход за кожей стоп

 

Чтобы ваш домашний педикюр был идеальным, необходимо уделить должное внимание ступням ног. Наша цель – удалить лишнюю огрубевшую кожу. Ваш первый помощник в этом деле – это пемза. Если кожа недостаточно размягчилась, подержите ноги в теплой ванночке еще 10 минут, затем обработайте пемзой стопы и пятки. Также отлично помогают избавиться от огрубевших частиц кожи пиллинги и скрабы для ног.

После такой процедуры очищенная кожа нуждается в увлажнении и питании, поэтому смажьте пятки питательным кремом и сделайте легкий массаж.

Маленький совет: если вы мучаетесь от повышенной потливости ног, смажьте ступни специальным дезодорантом-кремом.

 

Потрескавшиеся пятки и натопыши

 

Если кожа на пятках слишком запущена, у вас имеются плотные натопыши или трещины на пятках, с помощью обычной процедуры педикюра ситуацию не исправить. Существуют проверенные народные методы, которые помогут за пару недель сделать кожу на пятках нежной и шелковистой.

Для удаления затвердений и трещин нанесите питательную маску на пятки, оберните их целлофаном и наденьте носки. Держать лечебную маску рекомендуется всю ночь, а наутро смыть и смазать ноги увлажняющим кремом. Через несколько процедур результат вас удивит.

 

SPA-педикюр в домашних условиях

 

Если вы располагаете достаточным количеством времени, вы можете побаловать свои ножки SPA-педикюром в домашних условиях. Процедура включает в себя приятную расслабляющую ванночку для ног с эфирными маслами и увлажняющую питательную маску.

Подготовьте тазик с теплой водой, добавьте любимое ароматическое масло, опустите ноги в воду и получайте удовольствие 10-30 минут. Когда кожа на ногах размягчится, помассируйте ступни с применением скраба. Таким образом вы очистите ступни от огрубевшей кожи, они станут нежными и гладкими.

Следующий этап домашнего СПА-педикюра — увлажняющая питательная маска для ног. Для этого можно взять ваш любимый питательный крем и нанести на ступни толстым слоем. Затем оберните ноги целлофаном и наденьте носочки. Такую маску нужно держать не менее 2 часов, а лучше – всю ночь. Через несколько процедур ваши пяточки станут нежные, как у младенца.

В качестве маски можно воспользоваться специальными SPA-наборами для педикюра, в состав которых входят различные ухаживающие препараты.

Отличным ухаживающим эффектом обладают натуральные маски для ног, которые можно приготовить в домашних условиях. При регулярном использовании они подарят вашим ножкам идеальный вид.

 

Завершающий этап педикюра – наносим лак.

 

Последний этап педикюра в домашних условиях — это нанесение лака. Здесь все зависит от вашего вкуса. Можно просто нанести бесцветный лак для блеска и укрепления ногтей. Утонченные модницы могут позволить себе настоящий шедевр яркой росписи на ногтях.

В первую очередь нужно обезжирить ногтевую пластину от остатков крема и косметических средств. Если этого не сделать, лак плохо ляжет и не будет держаться.

Теперь подготовимся к нанесению лака – положите ватные тампоны или специальные разделители между пальцев, чтобы лак наносился аккуратно и не смазался.

Первым слоем рекомендуется нанести бесцветную основу. Благодаря этому ноготь будет защищен от токсинов, содержащихся в цветном лаке, кроме того, поверхность ногтя станет гладкой и лак зафиксируется намного прочнее. Ваш красивый педикюр надолго сохранит свежий вид.

Дождитесь полного высыхания бесцветной основы, затем можно приступать к нанесению цветного слоя лака. Чтобы всегда выглядеть модно и стильно, выбирайте актуальный цвет педикюра для каждого сезона. Модные цвета лака для педикюра в зимний период обычно более спокойные – белый, бежевый, прозрачный. Летний педикюр может быть выполнен в более смелых, оригинальных оттенках, которые будут гармонировать с цветом вашей одежды или подходить вам по цветотипу.

Цветной лак желательно наносить не менее двух слоев, чтобы получился насыщенный, устойчивый цвет.

В завершение профессионального педикюра желательно нанести слой лака-закрепителя. Он поможет надолго удержать лак на ваших ногтях.

 

Салоны красоты в Витебске>>>

 

http://www.beautydream.ru/

Фото

Фото

Фото

Нарост на кутикуле пальца ноги при травмации кровоточит — Вопрос дерматологу

Если вы не нашли нужной информации среди ответов на этот вопрос, или же ваша проблема немного отличается от представленной, попробуйте задать дополнительный вопрос врачу на этой же странице, если он будет по теме основного вопроса. Вы также можете задать новый вопрос, и через некоторое время наши врачи на него ответят. Это бесплатно. Также можете поискать нужную информацию в похожих вопросах на этой странице или через страницу поиска по сайту. Мы будем очень благодарны, если Вы порекомендуете нас своим друзьям в социальных сетях.

Медпортал 03online.com осуществляет медконсультации в режиме переписки с врачами на сайте. Здесь вы получаете ответы от реальных практикующих специалистов в своей области. В настоящий момент на сайте можно получить консультацию по 74 направлениям: специалиста COVID-19, аллерголога, анестезиолога-реаниматолога, венеролога, гастроэнтеролога, гематолога, генетика, гепатолога, гериатра, гинеколога, гинеколога-эндокринолога, гомеопата, дерматолога, детского гастроэнтеролога, детского гинеколога, детского дерматолога, детского инфекциониста, детского кардиолога, детского лора, детского невролога, детского нефролога, детского онколога, детского офтальмолога, детского психолога, детского пульмонолога, детского ревматолога, детского уролога, детского хирурга, детского эндокринолога, дефектолога, диетолога, иммунолога, инфекциониста, кардиолога, клинического психолога, косметолога, липидолога, логопеда, лора, маммолога, медицинского юриста, нарколога, невропатолога, нейрохирурга, неонатолога, нефролога, нутрициолога, онколога, онкоуролога, ортопеда-травматолога, офтальмолога, паразитолога, педиатра, пластического хирурга, подолога, проктолога, психиатра, психолога, пульмонолога, ревматолога, рентгенолога, репродуктолога, сексолога-андролога, стоматолога, трихолога, уролога, фармацевта, физиотерапевта, фитотерапевта, флеболога, фтизиатра, хирурга, эндокринолога.

Мы отвечаем на 96.59% вопросов.

Оставайтесь с нами и будьте здоровы!

Кутикула — обзор | ScienceDirect Topics

3.4.1 Дубление кутикулы

Дубление кутикулы включает два отдельных процесса: склеротизацию и меланизацию. Перед вылуплением новообразованная кутикула насекомого состоит из тонкого слоя гидрофобной, воскообразной эпикутикулы, не содержащей хитина, и толстого слоя прокутикулы, богатой белком и хитином (Locke, 2001). При вылуплении внешняя часть прокутикулы быстро сшивается дубильными агентами N -ацетилдопамин (НАДА) и N -β-аланилдопамин (НБАД) с образованием слоя затвердевшей экзокутикулы, а внутренняя часть прокутикулы остается. несшитые с образованием эндокутикулы.

NADA и NBAD синтезируются из аминокислоты-предшественника тирозина, который сначала гидроксилируется до DOPA с помощью тирозингидроксилазы, а затем декарбоксилируется до дофамина с помощью допа-декарбоксилазы (Andersen, 2005). Для склеротизации дофамин N- ацилируется до NADA и NBAD дофамин N -ацетилтрансферазой. Оба производных секретируются эпидермальными клетками в кутикулу, где они затем ферментативно окисляются и сшиваются с различными остатками нуклеофильных белков и хитином.В результате кутикула затвердевает и становится более гидрофобной. В общем, кутикулы, склеротизированные исключительно NADA, бесцветны или светлоокрашены, а кутикулы, склеротизированные с повышенным вкладом NBAD, дают более темную кутикулу. Таким образом, потемнение кутикулы может происходить без участия меланина.

При меланизации кутикулы дофамин также превращается в нерастворимый меланин через 5,6-дигидроксииндол. Меланин может быть связан с гранулированными белками или может быть распределен по всему кутикулярному матриксу, придавая кутикуле темный цвет.Меланин, вероятно, также образует связи с кутикулярными белками, способствуя прочности кутикулы (Andersen, 2005). Таким образом, дофамин является центральной молекулой как для склеротизации, так и для меланизации. Селигман и др. (1969) предположили, что превращение тирозина в ДОФА регулируется бурсиконом, и первоначально считалось, что процесс превращения происходит в гемоцитах (Mills and Whitehead, 1970). Однако более поздние данные ясно указывают на то, что превращение тирозина в ДОФА происходит в эпидермальных клетках (Seligman, 1980; Reynolds, 1983).Наиболее вероятно, что бурсикон может действовать на рецепторы LGR2 в стенках эпидермиса, чтобы стимулировать гидроксилирование тирозина до ДОФА, поскольку эпидермис является основной тканью, участвующей либо в производстве метаболитов, необходимых для загара, либо в качестве клеточного слоя, через который поступает дофамин. метаболиты должны пересечься, чтобы достичь внеклеточного пространства.

В процессе дубления кутикулы используются несколько ферментов для обеспечения метаболического процесса. Они включают, но не ограничиваются ими, дифенолоксидазы, лакказы, пероксидазу, тирозингидроксилазу, допа-декарбоксилазу и N -ацетилтрансферазу.Активность этих ферментов может регулироваться на транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях. В красном мучном жуке, т.р. castaneum , лакказа 2 является единственной фенолоксидазой, активность которой необходима для дубления кутикулы. РНКи гена лакказы 2 вызывает дефекты дубления кутикулы (Arakane et al. , 2005), указывая на то, что она регулируется на уровне транскрипции. Однако не все гены, участвующие в процессе дубления, регулируются на уровне транскрипции.Например, уровень мРНК тирозингидроксилазы, ключевого фермента, опосредующего превращение тирозина в ДОФА в процессе биосинтеза дубильного вещества, остается неизменным в течение периода дубления кутикулы до и после появления имаго (Davis et al. , 2007). . Это свидетельствует о том, что активность тирозингидроксилазы в процессе склеротизации (от 0 до 3 ч после вылупления) не регулируется на транскрипционном уровне. Тирозингидроксилаза кратковременно активируется во время загара кутикулы по посттрансляционному механизму, то есть фосфорилированию PKA (Davis et al., 2007). Другим примером является дофа-декарбоксилаза, которая катализирует превращение ДОФА в дофамин, соединение, имеющее центральное значение для склеротизации и меланизации. Уровень мРНК дофа-декарбоксилазы достигает пика за 24 часа до вылупления и затем снижается. Он почти не меняется или уменьшается минутно от 0 до 3 ч после вылупления. Дофа-декарбоксилаза транскрибируется и транслируется перед выделением, чтобы гарантировать присутствие активности фермента, когда субстрат становится доступным (Davis et al., 2007).

Все данные указывают на то, что бурсикон является нейропептидом, ответственным за дубление кутикулы и расширение крыльев у только что закрывшихся взрослых особей. Однако недавние данные показывают, что бурсикон может не быть необходимым для склеротизации кутикулы у всех взрослых насекомых. Воздействие 20 мкМ 20E в течение 3 дней на фрагменты ног только что вылупившегося взрослого таракана Blaberus craniifer вызывало аполиз вновь синтезированной кутикулы (Weber, 1995), что является классической функцией 20E. Что было удивительно, так это то, что новая экзокутикула была отложена и склеротизована.Поскольку в этих условиях культивирования бурсикон отсутствует, новая кутикула должна быть склеротизована в отсутствие бурсикон. У T. castaneum инъекция дцРНК генов, кодирующих субъединицы бурсикона (burs и pburs) и его рецептор (Tcrk), в куколки фарата не приводила к видимым дефектам склеротизации или пигментации взрослых особей, но вызывала дефекты расширение крыла (Arakane и др. , 2008). Однако, когда dsRNA этих генов вводили личинкам последней стадии на ранней стадии, это действительно влияло на дубление кутикулы и расширение крыльев (Bai and Palli, 2010), что указывает на то, что время РНК-интерференции генов-мишеней имеет решающее значение для анализа функции генов.

Хотя было показано, что бурсикон опосредует дубление кутикулы и расширение крыльев у только что закрывшихся взрослых насекомых, это не означает, что гормон проявляет какое-либо физиологическое действие, приводящее к дублению кутикулы на стадиях личинки и куколки. Различные переносимые кровью факторы дубления были обнаружены на разных стадиях развития у одних и тех же видов насекомых. Склеротизация пупария у высших двукрылых контролируется бурсиконоподобной молекулой, называемой фактором дубления пупариона (PTF; Zdarek and Fraekel, 1969; Zdarek, 1985). Исследования на S. bullata привели к идентификации двух дополнительных гормонов, фактора передней ретракции (ARF) и фактора иммобилизации пупария (PIF), которые участвуют в контроле образования пупария и фактического дубления старой личиночной кутикулы. с образованием затвердевшего пупария (Sivasubramaniun et al. , 1974; Zdarek, 1985). PTF личинок мясной мухи не проявлял дубильной активности в анализе бурсикон взрослых мясных мух, а его молекулярная масса и характер распределения в ЦНС отличались от таковых у бурсикон.

Резилин и хитиновая кутикула образуют композитную структуру для накопления энергии при прыжках цикад | BMC Biology

У интактной цикадки-лягушки при освещении УФ-светом вентральной поверхности заднегруди, включая проксимальные сегменты двух задних ног, были выявлены два двусторонне-симметричных пятна яркой синей флуоресценции (рис. 2А и 2В). Каждый участок, по-видимому, состоял из двух частей, разделенных узким нефлуоресцентным промежутком.

Одна часть длиной примерно 250 мкм и шириной 100 мкм отходит кпереди-латерально от оси между трохантином, передним и латеральным краем тазика и заднегруди.Второй имел С-образную форму, одна рука отходила вперед и латерально, а другая назад и латерально. Оба плеча имели длину около 250 мкм. Отношение сигнал/шум флуоресценции в тазобедренном суставе было высоким, так что очертания структуры были четко очерчены. Никакой другой синей флюоресценции сравнимой интенсивности не наблюдалось ни в заднегруди, ни в задних лапах. Этот образец флуоресценции был одинаковым у всех исследованных интактных взрослых цикад
Aphrophora
и Philaenus .Мягкие суставные мембраны между проксимальными суставами задних ног, однако, демонстрировали более слабую флуоресценцию, которая также наблюдалась с другими наборами фильтров, в отличие от плевральной дуги.

Рисунок 2

Флуоресцентные структуры в заднегруди Aphrophora и Philaenus .

Видимая снаружи флуоресценция в правой (А) и левой (В) латеральной оси грудно-тазовых суставов задних ног Aphrophora .Изображения в светлом поле и изображения, освещенные ультрафиолетовым светом (см. Методы) в одном и том же положении и фокальной плоскости, накладываются друг на друга. (C) Вентральный вид внутренней заднегруди Philaenus после удаления вентральной кутикулы и грудных мышц. Плевральные дуги, соединяющие тазики с шарнирами задних крыльев, обведены штриховыми линиями. Часть каждой плевральной дуги флуоресцирует ярко-синим цветом.

Дальнейшее исследование заднегруди после поверхностной диссекции показало, что внешне видимая флуоресценция представляет собой лишь небольшую часть гораздо более крупной и сложной внутренней структуры, простирающейся от вентральной поверхности дорсально (рис. 2С).Лукообразная структура с яркой синей флуоресценцией была обнаружена как часть плевральной дуги после удаления тонкой кутикулы заднегруди и нижележащих мышц, которые двигают вертлуг и тазик.

У Aphrophora эта флуоресцентная дуга имела длину 1084 ± 20,1 мкм (среднее ± стандартная ошибка среднего, N = 5), ширину 504 ± 17,9 мкм ( N = 8) и толщину 127 ± 2,4 мкм ( N = 7). Внешне видимая часть этой дуги (рис. 2А и 2В) представляет собой грудную часть сочленения с тазиком.С этой точки дуга изгибается латерально и дорсально, но заканчивается примерно на 430 мкм ниже места сочленения с задним крылом (рис. 3А-С). Таким образом, флуоресцентная часть составляет около 70% общей длины внутренней скелетной структуры, плевральной дуги, между задними тазиками и шарниром заднего крыла.

Рисунок 3

Интенсивная синяя флюоресценция в части плевральной дуги левой половины заднегруди Aphrophora . (А) вентральный вид.Вентральная кутикула и мышцы левой заднегруди удалены, но трахеи и некоторая жировая ткань остаются медиально. (B) Медиальный вид, вид наружу после того, как заднегрудь была разделена по средней линии и удалены мышцы. (C) Боковой вид из монтажа фотографий. Латеральная стенка и мышцы заднегруди удалены. Пунктирные линии обозначают контур всей плевральной дуги. Флуоресцентная часть четко изогнута вперед-назад (А и С) и дорсо-вентрально (В и С).

Эти наблюдения показывают, что дуга из флуоресцентного материала является составной частью плевральной дуги, соединяющей тазик вентрально с шарниром заднего крыла дорсально, и что сама дуга представляет собой составную структуру из флуоресцентного и нефлуоресцентного материала (рис. 1, 2С и 3). Вентральный конец флуоресцентного материала образует латеральный шарнир с тазиком (грудно-тазиковое сочленение), но его дорсальный конец не доходит до сочленения заднего крыла. Таким образом, сочленение с замком крыла образуется исключительно за счет хитиновой кутикулярной части плевральной дуги.

Развитие флуоресценции у личинок

Личинки Philaenus живут замкнутой жизнью, окруженные пеной, образующейся при вдувании воздуха в их мочу. В отличие от свободноживущих взрослых особей, последующие личиночные стадии не могут прыгать, но после последней линьки взрослые особи могут прыгать в течение нескольких минут после выхода из пены. Поэтому мы исследовали флуоресценцию личинок разного размера, чтобы увидеть, существует ли корреляция между наличием флуоресценции и прыжками.

У самых маленьких исследованных нами личинок, длина тела которых составляла 4–5 мм, или менее половины длины тела взрослой особи, не было обнаружено флуоресценции в латеральном шарнире грудо-тазобедренного сустава, хотя вентральная кутикула была более прозрачным (рис. 4A и 4B). Однако флуоресценция была обнаружена в мягкой суставной мембране проксимальных суставов задних ног и в сосущем ротовом аппарате, выступающем так далеко назад, как передний край задних тазиков (рис. 4А). У личинок длиной более 5 мм в плевральных дужках начинало появляться свечение.У некоторых личинок интенсивность флуоресценции была выше с одной стороны, чем с другой, что указывает на то, что процесс отложения идет, но с некоторой задержкой между двумя сторонами (рис. 4С). Наконец, на поздних личиночных стадиях флуоресценция в плевральных дугах была интенсивной и всегда присутствовала с обеих сторон тела (рис. 4D).

Рисунок 4

Развитие флуоресценции во время созревания последовательных личиночных стадий Philaenus .(A) и (B) У двух личинок с длиной тела 4,1 мм и 4,8 мм не было флуоресценции в грудо-тазобедренных суставах, как это было у взрослых (диагональные желтые стрелки). Некоторая флуоресценция проявляется в мягкой мембране между проксимальными суставами задних ног и в ротовом аппарате (горизонтальная черная стрелка на А). (C) Более крупная личинка (длина тела 5,2 мм) показывает сильную флуоресценцию в грудно-тазобедренном суставе левой задней ноги, но слабую в правой задней лапе. (D) На личиночной стадии (длиной 6,7 мм), предшествующей окончательной линьке во взрослую жизнь, флуоресценция присутствует в обоих грудо-тазобедренных суставах.На (А) две задние ноги сфотографированы на одном изображении, на (В)-(Г) они представлены на двух изображениях. Пунктирные линии указывают среднюю линию.

Природа флуоресценции

Интенсивная синяя флуоресценция имела общие характеристики возбуждения и испускания белка резилина. Чтобы предоставить дополнительные доказательства того, что флуоресценция обусловлена ​​резилином, мы проанализировали его свойства при кислом и щелочном рН, которые, как известно, влияют на флуоресценцию резилина [25, 28, 31]. Интенсивность флуоресценции измеряли по цифровым изображениям, полученным при постоянной экспозиции из области длиной 1 мм, которая охватывала большую часть флуоресценции, если смотреть сбоку (рис. 5).Первоначально насекомое было помещено в физиологический раствор с рН 7,2, и как только повторные измерения показали, что интенсивность флуоресценции была постоянной, физиологический раствор был заменен кислым физиологическим раствором с рН 2. Через 13 минут в этом солевом растворе интенсивность флуоресценция постепенно снижалась (рис. 5А). Затем этот солевой раствор был заменен солевым раствором с рН 12, и в течение следующих 30 минут интенсивность флуоресценции постепенно увеличивалась, пока не превзошла интенсивность в начале эксперимента (рис. 5А).Ни спад флуоресценции, ни ее последующее восстановление не полностью стабилизировались за отведенное здесь время, возможно, из-за времени, необходимого для проникновения в эту большую структуру, или из-за присутствия другого флуоресцентного материала.

Рисунок 5

Изменение интенсивности флуоресценции при рН . (A) Вид сбоку на правую половину заднегруди после удаления кутикулярной боковой стенки и грудных мышц; исходные цветные изображения, сделанные в указанное время, были преобразованы в черно-белые.Первоначально насекомое находилось в солевом растворе при рН 7,2, а в момент времени 0 минут его заменили солевым раствором при рН 2, а через 13,5 минут — солевым раствором при рН 12. При кислом рН интенсивность флуоресценции постепенно снижалась, но снова увеличивалась в щелочной рН. (B) График изменений интенсивности, измеренных по цифровым изображениям, например, показанным на (A). Красные квадраты и линии: суммарная флуоресценция по пикселям, нормализованная, в пределах контура длиной примерно 1 мм, нарисованного так, чтобы покрыть самую яркую часть плевральной дуги.Черные закрашенные кружки: нормализованное среднее значение максимальной интенсивности флуоресценции ± 1 стандартное отклонение, зарегистрированное вдоль 10 линий длиной приблизительно 0,55 мм и расстоянием между ними 0,1 мм, ортогонально длинной оси плевральной дуги. Синие круги: фоновая флуоресценция, определенная как средняя минимальная интенсивность ± 1 стандартное отклонение от тех же линий.

Для количественной оценки этих изменений были проведены три серии измерений (см. Методы и Рисунок 5B). Сначала нормировали суммарную флуоресценцию по пикселям в пределах определенной области, а затем строили график, чтобы получить меру интегральной плотности флуоресценции.Во-вторых, интенсивность нормализованной, средней, максимальной флуоресценции и ±1 стандартное отклонение (SD) регистрировали на 10 линиях, приблизительно ортогональных длинной оси структуры. В-третьих, фоновая флуоресценция по той же шкале оценивалась как средняя минимальная интенсивность ± 1 стандартное отклонение, полученная для тех же линий. Профили подтвердили, что флуоресценция уменьшилась почти наполовину в кислом солевом растворе, а затем обратимо восстановилась в щелочном солевом растворе, в конечном итоге превысив в некоторых местах интенсивность, впервые зарегистрированную в нейтральном солевом растворе (рис. 5В).

Парциальный спектр излучения синей флуоресценции

Спектр излучения синей флуоресценции усредняли по шести плевральным дугам при пяти длинах волн от 420 до 480 нм, ограниченных наличием эмиссионного фильтра Semrock. Результирующий частичный спектр (рис. 6) отклонялся от максимума около 420 нм, ожидаемого для спектров резилина и его основных детерминант, дитирозина и тритирозина [25, 27]. Однако в полученных спектрах постоянно обнаруживался пик в области 460–470 нм, не характерный ни для резилина, ни для производных тирозина.Это снова указывает на то, что в плевральной дуге может присутствовать второй компонент с синей флуоресценцией, который не является резилином, возможно, тот же компонент, на который влияет флуоресценция, оставшаяся при pH 2 (рис. 5).

Рисунок 6

Частичный спектр излучения флуоресценции . Плевральные дуги были измерены в шести Aphrophora (заштрихованные квадраты ± 1 стандартное отклонение) с использованием пяти дополнительных интерференционных фильтров с пиками, попадающими в полосу пропускания 413–483 нм эмиссионного фильтра Semrock.Эти измерения сравниваются с известными спектрами излучения нативного резилина (ромбики, от Andersen [25]) и синтезированного дитирозина (закрашенные кружки, от Malencik et al. [27]).

границ | Замалчивание Adc и Ebony вызывает аномальное потемнение кутикулы у Henosepilachna vigintioctopunctata

Введение

У насекомых кутикула обеспечивает защиту от физических травм и потери воды, жесткость для прикрепления мышц и механической поддержки, а также гибкость в межсегментарных и суставных областях для подвижности.Во время роста и метаморфоза насекомым необходимо регулярно сбрасывать старые экзоскелеты и синтезировать новые кутикулы, чтобы соответствовать постоянно увеличивающимся размерам тела и формам тела, зависящим от стадии. Новообразованная кутикула, в основном состоящая из кутикулярных белков, хитина и склеротизированных реагентов, нуждается в дублении, процессе, связанном с меланизацией и склеротизацией (Sugumaran and Barek, 2016). Более того, меланизация и склеротизация кутикулы насекомых также определяют пигментацию и играют важную роль в экологической адаптации, такой как бегство от хищников, мимикрия, половой отбор, передача сигналов и терморегуляция (Wright, 1987; True, 2003; Wittkopp, Beldade, 2009; Вант Хоф и др., 2011).

С биохимической точки зрения меланизация и склеротизация кутикулы насекомых являются результатом сочетания темно-черного и коричневого меланина и светло-желтого и бесцветного склеротина (Wright, 1987; True, 2003; Wittkopp et al., 2003; Wittkopp and Beldade, 2009; Жан и др., 2010). Эти меланизирующие и склеротизирующие реагенты производятся из тирозина. Тирозингидроксилаза (TH) превращает тирозин в допа. Затем дофа-декарбоксилаза (ДДК) превращает дофа в дофамин.Допа и дофамин далее превращаются в соответствующие меланины (Andersen, 2010). Продукция склеротинов из дофамина была выяснена у Drosophila melanogaster (Phillips et al., 2005). Существует четыре стадии реакции: (1) N-ацилирование дофамина ацетил-КоА до N-ацетилдопамина (НАДА). (2) Декарбоксилирование аспарагиновой кислоты до β-аланина аспартат-1-декарбоксилазой (ADC, Black). (3) N-ацилирование дофамина β-аланином с образованием N-β-аланилдоамина (NBAD) с помощью NBAD-синтазы (Ebony).Эта реакция обратима, обратная реакция катализируется гидролазой NBAD (Tan). (4) окисление NADA и NBAD до NADA-хинона и NBAD-хинона, которые полимеризуются с образованием соответствующих N-ацилхиноидных склеротинов (Phillips et al., 2005; Simon et al., 2009; Noh et al., 2016; Мун и др., 2020).

Подтверждена важность нормальной пигментации двух ферментов, ADC и Ebony (Mun et al., 2020). Для ADC уровни β-аланина снижены в головах мутантов adc по сравнению с диким типом D.melanogaster (Hodgetts and Choi, 1974; Phillips et al., 2005; Borycz et al., 2012; Ziegler et al., 2013), у мутанта черного цвета Tribolium castaneum (Kramer et al., 1984) и черная куколка ( п.н. ) мутант Bombyx mori (Dai et al., 2015). Дефицит β-аланина вызывает недостаток NBAD и приводит к черному цвету тела (Kramer et al., 1984; Dai et al., 2015). Лечение β-аланином может вернуть этим мутантам фенотип дикого типа (Jacobs, 1974; Kramer et al., 1984; Роузленд и др., 1987; Wappner et al., 1996a,b; Филипс и др., 2005).

Что касается черного дерева, мутация или нокдаун черного дерева увеличивает количество черного пигмента у двукрылых насекомых D. melanogaster и Ceratitis capitata (Bridges and Morgan, 1923), чешуекрылых насекомых B. mori (Futahashi). , 2008) и Spodoptera litura (Bi et al., 2019), жесткокрылые насекомые Tenebrio molitor (Mun et al., 2020) и T.castaneum (Tomoyasu et al., 2009) и полужесткокрылое насекомое Oncopeltus fasciatus (Liu et al., 2016). Точно так же Tan был признан дополнительным фактором, способствующим меланизации у Heliconius (Ferguson et al., 2011). У D. melanogaster потеря Tan вызывает глобальное снижение паттернов меланина (True et al., 2005; Jeong et al., 2008). Однако важность NBAD в дублении кутикулы недостаточно хорошо сравнивалась между различными стадиями развития насекомых.

Henosepilachna vigintioctopunctata (Fabricius) (Coleoptera: Coccinellidae) — типичный многоядный вредитель, питающийся большим количеством растений Solanaceae и Cucurbitaceae в странах Азии (Zhang et al., 2018). Цветовая маркировка жука различна и изменчива на разных стадиях развития (Casari and Teixeira, 2015). Это предлагает очень подходящую модель для тестирования моделей пигментации. Здесь с использованием технологии РНК-интерференции (РНКи) три гена adc , ebony или tan , о которых сообщалось, что они участвуют в биосинтезе NBAD, были нокдаунированы на третьей стадии личинки H.вигинтиоктопунктата . Паттерны пигментации кутикулы были обнаружены и сопоставлены во время личиночно-личиночной, личиночно-куколочной и куколочно-взрослой линьки. Результаты показывают, что Adc и Ebony важны для пигментации кутикулы H. vigintioctopunctata , и предполагают, что большее количество NBAD присутствовало у взрослых особей и играло более важную роль в пигментации, чем личинки/куколки.

Материалы и методы

Насекомое

Henosepilachna vigintioctopunctata имаго были собраны с Solanum melongena L.в городе Нанкин, провинция Цзянсу, Китай, летом 2018 г. Жуков регулярно содержали в инсектарии при температуре 28 ± 1 °C, световом периоде 14:10 ч и относительной влажности 50–60 % с использованием картофеля (). Solanum tuberosum ) листвы на стадии вегетативного роста или молодых клубней для обеспечения достаточного питания. В соответствии с этим протоколом кормления личинки прошли четыре разных возраста с приблизительными периодами стадий первого, второго, третьего и четвертого возраста, равными 3, 2, 2 и 3 дням соответственно.Достигнув полного размера, личинки четвертого возраста прекращали питание, закрепляли концы брюшка к поверхности субстрата и переходили в предкуколочную стадию. Предкуколки окукливаются примерно за 2 дня. Куколки просуществовали около 4 дней, после чего появились взрослые особи.

Молекулярное клонирование

Реактив

TRIzol (Invitrogen, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США) использовали для выделения тотальной РНК в соответствии с протоколами производителя. Для количественного определения РНК использовали спектрофотометр NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США).Чистоту РНК определяли путем оценки коэффициентов поглощения оптической плотности (OD) при OD260/280 и OD260/230. Целостность РНК анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. Обратную транскрипцию выполняли с использованием набора реагентов PrimeScript™ RT с gDNA Eraser (TaKaRa Biotechnology Corporation Ltd., Далянь, Китай). Вкратце, реакцию инкубировали при 37°С в течение 15 мин, а затем при 85°С в течение 5 с. Синтезированные кДНК сохраняли при -20°С для дальнейшего использования.

Предполагаемые гены adc , ebony и tan были получены из данных транскриптома H. vigintioctopunctata (Zhang et al., 2018). Правильность последовательностей была подтверждена с помощью ПЦР с использованием праймеров в дополнительной таблице 1. Секвенированные кДНК были отправлены в GenBank (номера доступа: adc , MW380963; черное дерево , MW380964; и коричневый , MW380968).

Белковые последовательности ADC, Ebony и Tan других видов были получены из NCBI.Филогенетический анализ проводили с использованием программного обеспечения MEGA-X и метода соседнего соединения с 1000 бутстрэп-репликациями.

Синтез молекул дцРНК

Фрагменты кДНК, полученные из adc , ebony , tan и усиленного зеленого флуоресцентного белка ( egfp ), были, соответственно, амплифицированы с помощью ПЦР с использованием специфических праймеров (дополнительная таблица 1), конъюгированных с промотором РНК-полимеразы T7. . Эти целевые области были подвергнуты дополнительному поиску BLAST (BLASTN) против H.vigintioctopunctata данные транскриптома (Zhang et al., 2018) для выявления любых возможных нецелевых последовательностей, которые имели идентичное совпадение в 20 п.н. или более. ДцРНК синтезировали с использованием набора для транскрипции MEGAscript T7 High Yield Transcription Kit (Ambion, Остин, Техас, США) в соответствии с инструкциями производителя. Затем синтезированную дцРНК (в концентрации 5–8 мкг/мкл) определяли электрофорезом в агарозном геле и на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) (данные не представлены) и хранили при –80°С. °C до использования в последующем эксперименте.

Интерференция личиночной РНК

РНК-интерференцию личинок проводили по ранее описанному методу (Xu et al., 2020; Ze et al., 2021). Вкратце, аликвоту (0,1 мкл) раствора, включающую 300 нг dsRNA, инъецировали только что покрывшимся личинкам третьего возраста. Личинкам бланка и отрицательного контроля инъецировали одинаковые объемы растворов PBS и ds egfp соответственно. В качестве повторности была поставлена ​​группа из 15 инъецированных личинок. Каждую инъекцию дцРНК повторяли 8 раз.Три повтора (каждый повтор содержал не менее шести особей) были отобраны через 48 и 72 часа после инъекции для qRT-PCR для проверки эффективности РНКи. Еще две повторности использовали для наблюдения за фенотипом.

Было проведено три независимых биологических эксперимента с использованием только что отмерших личинок третьего возраста, и они были запланированы для определения эффектов РНК-интерференции Hvadc , Hvebony и Hvtan на поведение и дубление кутикулы полученных личинок, куколок и Взрослые.Три обработки были установлены следующим образом: фосфатно-солевой буфер (PBS), 300 нг ds egfp и 300 нг ds adc ; PBS, 300 нг ds egfp и 300 нг ds черного дерева ; или PBS, 300 нг ds egfp и 300 нг ds tan .

Количественная ПЦР в реальном времени

Для временного анализа экспрессии матрицы кДНК были получены из 3-дневных яиц, личинок первого, второго, третьего и четвертого возраста, предкуколок, куколок и взрослых особей с интервалом в 1 день (D0 указывает на только что линяющих личинок, куколки или недавно появившиеся взрослые особи).Для сравнения уровней экспрессии в разных частях отдельно собирали головы и остальные части (тела) 2-дневных личинок третьего возраста и 1-, 2- и 3-дневных личинок четвертого возраста. Каждая выборка содержала 10 особей и повторялась трижды. Для анализа эффектов обработок из обработанных личинок экстрагировали тотальную РНК. Каждая выборка содержала не менее шести особей и повторялась трижды. РНК экстрагировали с использованием набора SV Total RNA Isolation System Kit (Promega, Мэдисон, Висконсин, США).кДНК готовили в соответствии с инструкциями с использованием набора HiScript III RT SuperMix для количественной ПЦР (+gDNA Wiper) (Vazyme, Нанкин, Китай). КПЦР проводили на системе Applied Biosystems 7500 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) с ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Нанкин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Каждый 20 мкл реакционного раствора содержит 10 мкл 2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix, 0,4 мкл каждого праймера (10 мкМ), 1 мкл матрицы кДНК и 8.2 мкл воды без нуклеаз. Параметры циклирования: 1 цикл 95°С в течение 3 мин; 40 циклов 95°С и 60°С по 10 с и 30 с соответственно. Количественные измерения мРНК выполняли с помощью qRT-PCR в технической трехкратной повторности с использованием двух генов внутреннего контроля ( рибосомный белок S18 , HvRPS18 ; рибосомный белок L13 , HvRPL13 ; и праймеры, перечисленные в дополнительной таблице 1) в соответствии с опубликованные результаты (Lü et al., 2018). Отрицательный контроль RT (без обратной транскриптазы) и отрицательный контроль без матрицы были включены для каждого набора праймеров, чтобы подтвердить отсутствие геномной ДНК и проверить димер праймера или загрязнение в реакциях, соответственно.

Согласно ранее описанному методу (Bustin et al., 2009) образование специфических продуктов ПЦР подтверждали с помощью гель-электрофореза. Пару праймеров для каждого гена тестировали с 10-кратным логарифмическим разбавлением смеси кДНК для получения линейной стандартной кривой [точка пересечения (CP) построена в зависимости от логарифма концентрации матрицы], которую использовали для расчета эффективности пары праймеров. Все пары праймеров амплифицировали один продукт ПЦР с ожидаемыми размерами, показывали наклон менее -3.0 и продемонстрировал значения эффективности в диапазоне от 2,5 до 2,6. Данные анализировали методом 2 –ΔΔ CT , используя среднее геометрическое четырех генов внутреннего контроля для нормализации.

Обработка изображений и измерение интенсивности цвета

Цифровые фотографии всех фенотипов были сделаны с помощью стереомикроскопа Nikon SMZ 25 (Nikon, Япония). Изображения задних крыльев, полученные от 7-дневных взрослых особей, чьи личинки третьего возраста обрабатывали дцРНК, переносили на изображения стопки RGB, а интенсивность цвета в эквивалентных областях определяли как средние значения в оттенках серого (средняя яркость) с помощью программного обеспечения ImageJ.При этом измерении более низкая интенсивность цвета указывает на более темную пигментацию кутикулы (Noh et al., 2016). Все обработанные группы и соответствующие контрольные группы были сфотографированы в одинаковых условиях.

Анализ данных

Статистическую значимость различий в экспрессии мРНК или других биологических экспериментов среди групп лечения PBS, ds egfp и dsRNA определяли с помощью одностороннего дисперсионного анализа и теста Турции в программном обеспечении SPSS Statistics 20.0 (при P < 0.05). При измерении интенсивности окраски задних крыльев статистическую значимость различий в средних значениях серого между группами, обработанными дцРНК, оценивали с помощью теста Стьюдента t .

Результаты

Шаблон временного выражения

Adc , Ebony и Tan Стенограмма

Путем анализа данных транскриптома H. vigintioctopunctata и построения филогенетических деревьев были идентифицированы Hvadc , Hvebony и Hvtan (дополнительные рисунки 1–3).

Для выявления паттернов экспрессии Hvadc , Hvebony и Hvtan на разных стадиях развития была проведена qRT-PCR. Результаты показали, что Hvadc , Hvebony и Hvtan обнаруживались от эмбриона (яйца) до взрослых особей. Они достигли пика у 4-дневных куколок или 0-дневных взрослых особей. Более того, на первой, второй, третьей и четвертой личиночных стадиях и стадиях куколки уровни транскрипции Hvadc , Hvebony и Hvtan были высокими непосредственно перед и/или сразу после линьки и низкими в промежуточные этапы (рис. 1A–C).

Рисунок 1. Паттерны транскрипции генов adc , ebony и tan у Henosepilachna vigintioctopunctata . Для временного анализа экспрессии (A-C) матрицы РНК были получены из яиц 3-го дня, личинок с первого по четвертый возраст, предкуколок, куколок и взрослых особей (D0 указывает на только что экдизировавшиеся личинки или куколки или только что появившиеся взрослые особи). ). Каждый повтор включал 20–30 особей и было три независимых пула.Для анализа уровней экспрессии в разных регионах (D-F) головы и оставшиеся тела были отдельно собраны у 2-дневных личинок третьего возраста и 1-, 2- и 3-дневных личинок четвертого возраста. возрастные личинки. Повторность включала 10 особей, и каждый образец повторялся 3 раза. Все образцы были измерены в трех технических повторах с использованием qRT-PCR. Значения рассчитаны по методу 2 –ΔΔ CT . Самый низкий уровень транскрипта каждой из трех мРНК в определенное время разработки принимается равным 1.Относительные транскрипты представляют собой отношения числа копий на разных стадиях развития по отношению к личинкам в определенное время развития. Гены рибосомного белка S18 ( HvRPS18 ) и рибосомного белка L13 ( HvRPS13 ) использовали в качестве внутреннего контроля. Столбцы представляют средние значения с вертикальными линиями, указывающими ± SE. Е, яйцо; Н, голова; B, оставшееся тело без головы.

Уровни экспрессии Hvadc , Hvebony и Hvtan в головах личинок сравнивали с таковыми в телах 2-дневных личинок третьего возраста, а также 1-, 2- и 3-дневных личинок. личинки четвертого возраста.И Hvadc , и Hvebony были обильно транскрибированы в личиночных головках 2-дневных личинок третьего возраста и 1-дневных личинок четырех возрастов (рис. 1D, E). Точно так же уровни Hvtan в образцах головы личинок четвертого возраста в возрасте от 1 до 3 дней были выше, чем в телах (рис. 1F).

РНК-интерференция

Adc Почернение личинок

Через три дня после введения ds adc в только что экдизированных личинок третьего возраста накопленный уровень мРНК транскрипта-мишени был сильно подавлен (рис. 2А).

Рисунок 2. РНК-интерференция Hvadc затемняет личинок H. vigintioctopunctata . Вновь отмершие личинки третьей стадии инъецировали аликвотой (0,1 мкл) PBS или раствора, включающего 300 нг ds egfp или 300 нг ds adc . Затем личинки переносили на листву картофеля. Через два дня и через три дня после инъекции измеряли уровень экспрессии Hvadc (A) . Относительные транскрипты представляют собой отношение относительного числа копий у пролеченных индивидуумов к количеству копий у тех, кому вводили PBS, которое принимается за 1.Разные буквы обозначают значительные различия при значении P <0,05 с использованием ANOVA с тестом Тьюки-Крамера. Показаны дорсальные и вентральные виды обработанных личинок ds egfp (B, D) и ds adc (C, E) . Головы (F,G) , глазки и усики (H,I) , ротовой аппарат (J,K) , сколи и струмы (L,M) , задние ноги (N,O) , и конец брюшка (P, Q) были дополнительно амплифицированы.ES — эпикраниальный шов; FA, передние рычаги; М, ротовой аппарат; О, глазки; А, усики; С, скол; Т, зоб. Красные стрелки указывают на сосцевидные отростки на животе.

Все контроли (введенные PBS и ds egfp ) и личинки, обработанные ds adc , обычно линяли до личинок четвертого возраста. Однако цвет головы личинок Hvadc RNAi был темнее, чем у личинок, обработанных PBS и ds egfp (рис. 2B, D по сравнению с C, E), особенно ротовой аппарат (рис. 2F). против.G) и пятна вокруг личиночных глазков и антенн (рис. 2H против I). Кроме того, широкая кремовая полоса, называемая эпикраниальным швом (ES), была сужена, а V-образные лобные плечи и U-образное пятно на макушке головы были расширены у личинок Hvadc RNAi (рис. 2F по сравнению с G).

В ротовом аппарате контрольных личинок четвертого возраста (PBS- и ds egfp -injected) срединная часть верхней губы имеет кремовый цвет, а боковые и передние части имеют коричневатые узкие полосы.Другие придатки ротового аппарата, а именно нижняя челюсть, верхняя челюсть и губа, были черного цвета (рис. 2F, J). Напротив, у личинок Hvadc RNAi цвет всех пигментированных областей был более глубоким и почерневшим (рис. 2F, J по сравнению с G, K). Более того, сколи, зоб и ноги были более темного цвета у молчащих личинок Hvadc (рис. 2L, N по сравнению с M, O). Кроме того, небольшие сосцевидные отростки на брюшке были более темными у личинок, которым инъецировали ds adc , по сравнению с личинками, которым инъецировали ds egfp (рис.Е, Q).

Заглушение

Adc Влияет на окраску куколок

Нокдаун Hvadc повлиял не на морфологию куколки (рис. 3А) и скорость окукливания (рис. 3В), а на окраску.

Рисунок 3. Нокдаун Hvadc затемняет цвет куколки H. vigintioctopunctata . Только что перелинявшим личинкам третьей стадии инъецировали аликвоту (0,1 мкл) PBS или раствора, включающего 300 нг ds egfp или 300 нг ds adc .Затем личинки переносили на листву картофеля. Скорость окукливания была зарегистрирована в течение 3-недельного испытательного периода (B) . Средние значения (±SE), следующие за разными буквами, указывают на значительные различия при значении P <0,05 с использованием ANOVA с тестом Тьюки-Крамера. Показаны дорсальные и вентральные виды 2-дневных и 4-дневных куколок, личинки третьего возраста которых подверглись инъекции ds egfp и ds adc (A) . Головы 2-дневных куколок (C, D) и 4-дневных куколок (E, F) были дополнительно амплифицированы.MS, мезогрудь; MT, метагрудь; I–IV, тергиты I–IV; E, сложный глаз; А, антенна; М, ротовой аппарат; ФЛ, передняя нога; МЛ, средняя часть. Шкала баров: 1 мм.

Покровы 2-дневных куколок, развившихся из личинок третьего возраста, обработанных ds egfp или ds adc , обычно были бледно-желтыми, особенно на брюшной стороне (рис. 3A, левая панель). Затем общий цвет изменился на тускло-желтый у 4-дневных куколок (рис. 3А, правая панель). С дорсальной стороны парные черные отметины на средне- и метагруди, а также темные пятна на тергите I-IV были одинаковыми в контроле (обработанные ds egfp ) и куколках Hvadc RNAi (рис. 3A).

Однако усики и части рта 2-дневных Hvadc -молчащих куколок были почерневшими (рис. 3D), в то время как эти части 2-дневных куколок, обработанных ds egfp , не имели очевидной пигментации (рис. 3C). ). Через четыре дня после окукливания ротовой аппарат контрольной особи приобрел рыжий цвет, а цвет усиков и ног явно не изменился (рис. 3Е). Напротив, цвет кутикулы между двумя сложными глазами куколок Hvadc- с молчанием был явно темнее, и присутствовали явные центральные черные пятна и несколько небольших темных пятен (рис.Ф). Усики, ротовой аппарат и ноги стали темнее (рис. 3F).

Нокдаун

Adc Влияет на цвет кутикулы и крыльев взрослых особей

Частота появления куколок в группе, обработанной ds adc , составляла в среднем 95%, что не показывает существенной разницы с таковой в группе, обработанной PBS или ds egfp (рис. 4A). У взрослых особей Hvadc RNAi 28 черных отметин были симметрично распределены на двух твердых надкрыльях через 1 день после вылупления.Затем черные пигменты постепенно откладывались и, наконец, покрывали все тело со стороны спины через 7 дней после вылупления, в то время как пигментация контрольной (леченной ds egfp ) взрослой особи оставалась прежней (рис. 4B по сравнению с D). Точно так же пара черных отметин на грудине заднегруди была замечена у контрольных и однодневных взрослых особей Hvadc RNAi; в то время как все тело с вентральной стороны было затемнено у 7-дневных взрослых особей Hvadc RNAi (рис.Е). Нокдаун Hvadc вызвал общее потемнение пигментации надкрылий, что, по-видимому, связано с увеличением черных пятен (рис. 4F и G). Более того, просмотр амплифицированных надкрылий взрослых особей Hvadc RNAi показал, что все щетинки и кольцевые ямки были темного цвета, в отличие от красновато-коричневого цвета у контрольных жуков (рис. 4H по сравнению с I). Дальнейшее вскрытие головы, переднеспинки, щитка, задних ног и заднего крыла показало, что все эти области сместились в сторону более темной пигментации (рис. 4J и дополнительная рис. 4).Интенсивность окраски соответствующих областей задних крыльев показала значительную разницу между группами, получавшими ds adc и ds egfp (рис. 4K).

Рисунок 4. Сайленсинг Hvadc влияет на пигментацию у взрослых особей H. vigintioctopunctata . Только что перелинявшим личинкам третьей стадии инъецировали аликвоту (0,1 мкл) PBS или раствора, включающего 300 нг ds egfp или 300 нг ds adc . Затем личинки переносили на листву картофеля.Показатели появления и показатели нормальных взрослых особей были зарегистрированы в течение 3-недельного испытательного периода (A) . Средние значения (±SE), за которыми следуют разные буквы, указывают на значительные различия при P -значение <0,05 с использованием ANOVA с тестом Тьюки-Крамера. Показаны дорсальные (B, D) и вентральные (C, E) проекции 7-дневных взрослых особей, личинки третьего возраста которых подверглись обработке ds egfp или ds adc . Надкрылья (F, G) и поверхности надкрылий были дополнительно амплифицированы (H, I) .Задние крылья (J) и интенсивность цвета (K) в их эквивалентных областях (кружки 1 и 2 в J ) определяли как средние значения серого (средняя яркость) с помощью программного обеспечения ImageJ. Данные представлены в виде средних значений ± SE ( n = 6). Звездочка указывает на значительную разницу в интенсивности окраски между контрольными и подопытными жуками ( P < 0,01, t — тест). Белые и красные стрелки указывают на кольцевые ямки и щетинки соответственно.МЭ, заднегрудь.

РНК-интерференция

Ebony на личинках третьего возраста

Поскольку и Adc, и Ebony играют центральную роль в синтезе NBAD (Massey et al., 2019), мы подавили экспрессию Hvebony путем инъекции ds ebony в только что отмершие личинки третьего возраста ( Рисунок 5А).

Рисунок 5. Истощение Hvebony влияет на пигментацию личинок H. vigintioctopunctata .Только что перелинявшим личинкам третьей стадии инъецировали аликвоту (0,1 мкл) PBS или раствора, включающего 300 нг ds egfp или 300 нг ds черного дерева . Затем личинки переносили на листву картофеля. Через два дня и через три дня после инъекции измеряли уровень экспрессии Hvebony (A) . Относительные транскрипты представляют собой отношение относительного числа копий у обработанных особей к количеству обработанных PBS, которое принимается за 1. Частота окукливания и вылета была зарегистрирована в течение 3-недельного испытательного периода (B,C) .Разные буквы обозначают значительную разницу при значении P- <0,05 с использованием дисперсионного анализа с тестом Тьюки-Крамера. Спинной и вентральный виды ds egfp — и ds ebony — обработанных личинок (D) и усиленных личиночных голов (E) в разное время после линьки до четвертого возраста, а также дорсальные и вентральные виды показаны личинки в стадии блуждания (F–I) . Головы личинок блуждающей стадии были дополнительно амплифицированы (J,K) .Немаркированные масштабные линейки: 1 мм.

Скорость окукливания и скорость появления личинок Hvebony RNAi были аналогичны контрольным личинкам, которым вводили PBS или ds egfp (рис. 5B, C). Челюсти были более темного цвета у интродуцированных ds ebony только что линяющих личинок четвертого возраста по сравнению с таковыми у контрольных личинок, обработанных PBS или ds egfp (рис. 5D, E, 15 мин). Через восемь часов после линьки сколи и струмы от грудной клетки личинки до восьмого сегмента брюшка, а также голова и нога стали коричневатыми у личинок, интродуцированных PBS и ds egfp (рис. 5D, E, вверху).Напротив, цвет частей тела, а именно головы, сколи, струмы и ног, стал темно-коричневым у личинок, обработанных ds ebony (рис. 5D, E, нижние панели).

Аналогичным образом, на стадии блуждания кутикулы головных капсул личинок, сколи, струмы, ноги и пятна на брюшке у личинок Hvebony RNAi были более почерневшими, чем у контрольных личинок (рис. 5F, H, J против .Г,И,К).

В куколках, интродуцированных ds ebony , черные дорсальные отметины на средне- и заднегруди и темные пятна на тергите I-IV не показали существенной разницы с куколками, обработанными PBS или ds egfp (рис. 6A).Однако нижние челюсти были темнее у 3-дневных/4-дневных Hvebony -молчаливых куколок, чем у куколок в контрольных группах (рис. 6А). Подобно фенотипу истощенных куколок Hvadc , в кутикуле между двумя сложными глазами 4-дневных куколок, интродуцированных ds ebony , появилось несколько небольших темных пятен (рис. 6B по сравнению с C). Кроме того, кутикула головы, ног, надкрылий и переднеспинки у 4-дневных куколок, интродуцированных ds ebony , стала значительно темнее, чем у куколок, которым вводили PBS или ds egfp (рис. 6B, D, F и .С, Д, Ж). Увеличенный вид сверху показал, что на кутикуле 4-дневных куколок, инъецированных ds ebony , появилось много коротких черных щетинок и точек, что сделало кутикулу более черной по цвету, чем контрольная (рис. 6F по сравнению с G).

Рисунок 6. РНК-интерференция Hvebony влияет на пигментацию куколок H. vigintioctopunctata . Дорсальные и вентральные виды 0-дневных, 1-дневных, 2-дневных, 3-дневных и 4-дневных куколок личинок третьего возраста, которым вводили ds egfp и dse bony (A) , показано.Головы (B, C) и вид сверху (F, G) 4-дневных куколок были дополнительно увеличены. Показаны боковые виды 4-дневных куколок (D, E) . Немаркированные масштабные линейки: 1 мм.

Через 30 минут после появления надкрылья контрольных взрослых особей, обработанных PBS или ds egfp , все еще имели светло-желтый цвет. Впоследствии надкрылья стали медно-желтыми, и появилось 28 пятен, которые постепенно темнели (рис. 7А, ds egfp — вид сверху).Напротив, нокдаун Hvebony привел к общей серой пигментации и увеличению 28 темных пятен на надкрыльях в течение 30 мин после вылупления. Надкрылья взрослых особей Hvebony RNAi также постепенно темнели (рис. 7A, ds ebony — вид сверху), но они выглядели полностью черными через 7 дней после вылупления (рис. 7B по сравнению с C). Дальнейшее вскрытие головы, переднеспинки, щитка и задних конечностей взрослых особей Hvebony RNAi показало, что все эти области приобрели более темную пигментацию, чем контрольные взрослые особи (дополнительная фигура 4).Как и у взрослых особей Hvadc , 28 черных пятен на надкрыльях взрослых особей Hvebony , лишенных молчания, стали больше, чем на контрольных надкрыльях (рис. 7D по сравнению с E), а цвет щетинок и ямок на поверхность надкрылий была темнее, чем у контрольных надкрылий (рис. 7F по сравнению с G). Кроме того, пигментные области заднего крыла взрослых особей Hvebony RNAi были темнее, чем у контрольной особи (рис. 7H, I).

Рисунок 7. Истощение Hvebony углубляет окраску взрослых особей H.вигинтиоктопунктата . Верхний и вентральный вид взрослых особей в разное время после вылета (A) . Показаны 7-дневные взрослые особи (B, C) и надкрылья, рассеченные от 7-дневных взрослых особей (D, E) . Поверхности надкрылий были дополнительно амплифицированы (F, G) . Задние крылья (H) и интенсивность цвета (I) в их эквивалентных областях (круги 1 и 2 в H ) определяли как средние значения серого (средняя яркость) с помощью программного обеспечения ImageJ.Данные представлены в виде средних значений ± SE ( n = 6). Звездочка указывает на значительную разницу в интенсивности окраски между контрольными и подопытными жуками ( P < 0,01, t — тест). Немаркированные масштабные линейки: 1 мм. Белые и красные стрелки указывают на ямки и щетинки соответственно.

С вентральной стороны шесть пар темных пятен появились вдоль боковых частей на сегментах брюшка взрослых особей Hvebony RNAi, а последние две пары вытянулись и слились вместе.Бледно-желтый цвет за пределами темных пятен постепенно темнел до слияния темных пятен через 2 дня после появления (рис. 7А, ds черное дерево — вид снизу). Ноги и брюшко Hvebony -истощенных взрослых особей были более черного цвета, чем у контрольных жуков (рис. 7A, ds ebony — вид снизу).

РНК-интерференция

Tan на личинках третьего возраста

Через два и три дня после инъекции ds tan личинкам третьего возраста экспрессия целевого транскрипта Hvtan была значительно снижена по сравнению с контрольными личинками, которым вводили PBS или ds egfp (дополнительная фигура 5A).

Истощение Hvtan мало повлияло на скорость окукливания и появления (дополнительная фигура 7). Результаты измерения интенсивности окраски (данные не показаны) показали, что нокдаун Hvtan оказывал очень ограниченное влияние на пигментацию кутикулы на стадиях личинки, куколки и взрослой особи по сравнению с контролями, подвергнутыми инъекции PBS или ds egfp . (Дополнительные рисунки 5B, C, 6A – M). Кроме того, не было существенной разницы в интенсивности окраски задних крыльев между божьими коровками, обработанными ds egfp и ds tan (дополнительная фигура 6N).

Обсуждение

Конъюгация и перекрестное связывание белков кутикулы во время дубления кутикулы приводит к образованию нерастворимого, твердого и затемненного красно-коричневого экзоскелета жесткокрылых (Roseland et al., 1987). NBAD, склеротический реагент и предшественник пигмента, играют решающую роль в пигментации и отвердении кутикулы (Kramer et al., 1984). В этой статье были идентифицированы три гена ( Hvadc , Hvebony и Hvtan ), которые, как сообщается, участвуют в биосинтезе NBAD, и их роль в пигментации кутикулы личинок, куколок и взрослых особей H.vigintioctopunctata был исследован с помощью РНК-интерференции в только что отмерших личинках третьего возраста. Три экспериментальных данных свидетельствуют о том, что NBAD играет более важную роль в пигментации у взрослых особей, чем у личинок и куколок H. vigintioctopunctata .

Во-первых, мы обнаружили, что Hvadc , Hvebony и Hvtan были обнаружены от эмбриона (яйца) до взрослых особей. Более того, уровни транскрипции Hvadc , Hvebony и Hvtan были высокими непосредственно перед и/или сразу после линьки на первой, второй, третьей и четвертой личиночных стадиях и стадиях куколки (рис. 1).У S. litura , Slebony экспрессировались на всех стадиях развития, а именно, яйцеклетка, личинки с первого по шестой личиночный возраст, предкуколка, куколка и имаго (Bi et al., 2019). Точно так же ebony обильно экспрессируется на личиночной, куколочной и взрослой стадиях у P apilio xuthus и Papilio machaon (Li et al., 2015). У T. molitor многочисленные транскрипты были подтверждены на поздних стадиях развития от куколки фарата до 10-дневных взрослых особей (Mun et al., 2020). Профили экспрессии Hvadc , Hvebony и Hvtan предполагают, что три функциональных фермента катализируют образование меланина и склеротинов после каждой линьки на стадиях развития.

Во-вторых, экспрессия Hvadc , Hvebony и Hvtan достигла пика у 4-дневных куколок или 0-дневных взрослых особей H. vigintioctopunctata (рис. 1). Самые высокие уровни экспрессии во фразах поздней куколки и ранней взрослой особи предполагают, что обильные NBAD продуцировались у предвзрослых и взрослых особей.В соответствии с этими результатами самый высокий уровень Tmadc наблюдается сразу после появления имаго (0-й день взрослой особи) у T. molitor (Mun et al., 2020). Точно так же высокие уровни Slebony были обнаружены непосредственно перед и сразу после появления имаго у S. litura (Bi et al., 2019). Более того, Dmadc экспрессировался на высоком уровне в конце периода куколки (через 96 ч после окукливания) у D. melanogaster (Sobala, Adler, 2016).

Наконец, результаты показали, что РНКи либо Hvadc , либо Hvebony избирательно углубляла цвет личиночных головных капсул, сколисов, струм и ног (рис. 2, 5) и истощала Hvadc или Hvebony . почернели головные капсулы куколки, усики, ротовой аппарат и ноги (рис. 3, 6), в то время как нокдаун либо Hvadc , либо Hvebony затемнил все тело взрослых особей (рис. 4, 7) H.вигинтиоктопунктата . Большее накопление черных пигментов у истощенных взрослых особей Hvadc или Hvebony , вероятно, является результатом превращения большего количества дофамина в коричневый дофамин-меланин, чем у личинок. Следовательно, мы делаем вывод, что у взрослых особей присутствовало большее количество NBAD, чем у личинок/куколок.

Напротив, микроинъекция ds adc личинкам предпоследнего возраста не вызывает явного фенотипа у старых личинок T. castaneum , но приводит к более темной пигментации тела у куколок и взрослых особей по сравнению с контролем (Arakane et al., 2009). В мутантном штамме Bmadc B. mori β-аланин и NBAD были дефицитными, но дофамин накапливался. В результате у куколок индуцировалась глубокая окраска (Dai et al., 2015). Похоже, что NBAD так же важен для куколок, как и для взрослых особей T. castaneum (Arakane et al., 2009) и B. mori (Dai et al., 2015).

Как и в случае ebony , CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут ebony не изменил пигментацию у личинок, но привел к более темной окраске куколок и взрослых особей S.литура (Bi et al., 2019). У D. melanogaster гомозиготные мутации ebony вызывают пигментацию темного тела у взрослых мух, но не у личинок и куколок (Massey et al., 2019). Более того, основные энхансеры в гене ebony определяют интенсивность пигментации грудной клетки у различных штаммов D. melanogaster в разных географических градиентах (Telonis-Scott et al., 2011; Telonis-Scott and Hoffmann, 2018). Эти результаты свидетельствуют о том, что снижение синтеза NBAD приводит к аномальному накоплению высоких уровней дофамина, который, вероятно, подвергается синтезу дофамина-меланина, вызывая темную окраску кутикулы у взрослых насекомых из разных отрядов.Интересно, что хотя надкрылья взрослых особей, обработанных ds adc и ds ebony , кажутся почти полностью черными по цвету, мы обнаружили, что основными областями надкрылий, получившими темную пигментацию, были ямки и щетинки (рис. 4, 7). Сходным образом, уже в конце куколки эпидермальные щетинки уже имели черную окраску у истощенных куколок Hvebony (рис. 6). Это позволило предположить, что NBAD может в основном накапливаться в ямках и щетинках кутикулы H. vigintioctopunctata .

Известно, что NBAD является основным предшественником склеротизации, который секретируется в процессе дубления кутикулы. Далее он окисляется и используется для сшивания кутикулярных белков с образованием жесткого экзоскелета жесткокрылых на взрослой стадии (Noh et al., 2016). Более того, некоторые транскрипты генов пигментации, такие как ebony и tan , являются плейотропными генами, которые влияют более чем на один признак. У D. melanogaster мутации с потерей функции у ebony и tan также влияют на состав углеводородов кутикулы (Massey et al., 2019). Предпочтение углеводородов с длинной цепью повышает температуру плавления и позволяет мухам дольше жить в сухом климате (Gibbs, 1998). H. vigintioctopunctata — дневная травоядная божья коровка. Взрослые особи часто попадают в сухую среду в поисках пищи, мест откладки яиц и партнеров для совокупления. Твердый экзоскелет у взрослых особей обеспечивает большую устойчивость к высыханию и ультрафиолетовому излучению на стадии поиска пищи (Matute and Harris, 2013; Bastide et al., 2014).

Кроме того, мы заметили, что изменение пигментации кутикулы было очень ограниченным у жуков, обработанных ds tan (дополнительные рисунки 5, 6).Фермент, кодируемый tan , необходим для производства дофамина у D. melanogaster (True et al., 2005). В B. mori предполагается, что ген tan является ответственным за мутантную окраску личинок rouge , а Tan играет важную роль в подчеркивании черных отметин личинок (Futahashi et al., 2010). Предыдущие исследования показали, что Tan катализирует выработку дофамина из NBAD во время развития пигмента (True et al., 2005).Эта роль Tan кажется неочевидной у H. vigintioctopunctata . В сочетании с результатами РНК-интерференции Hvadc и Hvebony мы предположили, что Hvtan играет слабую роль в процессе превращения NBAD в дофамин у H. vigintioctopunctata .

Заключение

В заключение, исследование определило важную роль Adc и Ebony в пигментации кутикулы 28-пятнистой божьей коровки. Было высказано предположение, что большее количество NBAD присутствует у взрослых особей и играет более важную роль в пигментации, чем личинки/куколки.Обильный NBAD у взрослых особей может быть адаптационной стратегией в процессе дубления, приводящей к образованию незаметной пигментации у жуков H. vigintioctopunctata .

Заявление о доступности данных

Наборы данных, представленные в этом исследовании, можно найти в онлайн-репозиториях. Названия репозитория/репозиториев и инвентарные номера можно найти в статье/дополнительных материалах.

Вклад авторов

L-JZ, LJ и G-QL задумали исследование, участвовали в разработке экспериментов и интерпретации результатов и написали первый вариант рукописи.L-JZ и LJ провели эксперименты. LJ и G-QL пересмотрели рукопись. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию рукописи.

Финансирование

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (32072416) и Китайской системой сельскохозяйственных исследований MOF и MARA (CARS-09-P22).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphys.2022.829675/full#supplementary-material

Сноски

Каталожные номера

Аракан, Ю., Ломакин, Дж., Биман, Р.В., Мутукришнан, С., Герке, С.Х., Каност, М.Р., и соавт. (2009). Молекулярный и функциональный анализ декарбоксилаз аминокислот, участвующих в дублении кутикулы Tribolium castaneum . Дж. Биол. хим. 284, 16584–16594. дои: 10.1074/jbc.M

9200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бастида, Х., Yassin, A., Johanning, EJ, and Pool, JE (2014). Пигментация Drosophila melanogaster достигает своего максимума в Эфиопии и наиболее сильно коррелирует с ультрафиолетовым излучением в странах Африки к югу от Сахары. BMC Evol. биол. 14:179. doi: 10.1186/s12862-014-0179-y

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Bi, HL, Xu, J., He, L., Zhang, Y., Li, K., and Huang, Y. P. (2019). CRISPR/Cas9-опосредованное нокаутирование черного дерева приводит к пупариевому меланизму у Spodoptera litura . Наука о насекомых. 26, 1011–1019. дои: 10.1111/1744-7917.12663

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Борич, Дж., Борич, Дж. А., Эдвардс, Т. Н., Булианн, Г. Л., и Майнерцхаген, И. А. (2012). Метаболизм гистамина в оптической доле Drosophila включает омматидиальный путь: β-аланин рециркулирует через сетчатку. Дж. Экспл. биол. 215, 1399–1411. doi: 10.1242/jeb.060699

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мосты, К.Б. и Морган, Т. Х. (1923). Третья хромосомная группа мутантных признаков Drosophila melanogaster. Вашингтон, округ Колумбия: Вашингтонский институт Карнеги.

Академия Google

Бастин, С.А., Бенеш, В., Гарсон, Дж.А., Хеллеманс, Дж., Хаггетт, Дж., Кубиста, М., и соавт. (2009). Руководство MIQE: минимальная информация для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени. клин. хим. 55, 611–622. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Казари, С.А. и Тейшейра, Э. П. (2015). Неполовозрелые особи эпилахны шевролатной (Coleoptera, Coccinellidae, Epilachinae). Rev. Бюстгальтеры. Энтомол. 59, 113–120. doi: 10.1016/j.rbe.2015.03.006

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Dai, F.Y., Qiao, L., Cao, C., Liu, X.F., Tong, X.L., He, S.Z., et al. (2015). Аспартатдекарбоксилаза необходима для нормальной пигментации куколки тутового шелкопряда Bombyx mori . Науч. Респ. 5:10885. дои: 10.1038/srep10885

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фергюсон, Л.C., Maroja, L., и Jiggins, CD (2011). Конвергентное, модульное выражение черного и коричневого цветов в миметических рисунках крыльев бабочек Heliconius . Дев. Гены Эвол. 221, 297–308. doi: 10.1007/s00427-011-0380-6

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Футахаши Р., Банно Ю. и Фудзивара Х. (2010). Цветовые узоры гусениц определяются двухфазным процессом препаттернирования гена меланина: новые доказательства от tan и laccase2. Эволюция. Дев. 12, 157–167. doi: 10.1111/j.1525-142X.2010.00401.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Futahashi, R., Sato, J., Meng, Y., Okamoto, S., Daimon, T., Yamamoto, K., et al. (2008). желтый и черный являются генами, ответственными за мутанты окраски личинок тутового шелкопряда Bombyx Mori . Генетика 180, 1995–2005 гг. doi: 10.1534/genetics.108.096388

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джейкобс, М.Э. (1974). Бета-аланин и адаптация у дрозофилы . J. Физиология насекомых. 20, 859–866. дои: 10.1016/0022-1910(74)-9

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Чон С., Ребейс М., Андольфатто П., Вернер Т., Тру Дж. и Кэрролл С. Б. (2008). Эволюция регуляции генов лежит в основе морфологических различий между двумя сестринскими видами Drosophila . Сотовый 132, 783–793. doi: 10.1016/j.cell.2008.01.014

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Крамер, К.J., Morgan, T.D., Hopkins, T.L., Roseland, C.R., Aso, Y., Beeman, R.W., et al. (1984). Катехоламины и β-аланин у красного мучного жука, Tribolium castaneum : роль в склеротизации и меланизации кутикулы. Биохимия насекомых. 14, 293–298. дои: 10.1016/0020-1790(84)-5

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Li, X.Y., Fan, D.D., Zhang, W., Liu, G.C., Zhang, L., Zhao, L., et al. (2015). Секвенирование аутбредного генома и редактирование генов CRISPR/Cas9 у бабочек. Нац. коммун. 6:8212. дои: 10.1038/Ncomms9212

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лю Дж., Лемондс Т. Р., Марден Дж. Х. и Попадич А. (2016). Анализ путей формирования паттерна меланина у насекомого Hemimetabolous . Генетика 203:403. doi: 10.1534/genetics.115.186684

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лю, Дж., Чен, С. М., Го, М. Дж., Е, С. Ю., Цю, Б. Л., Ву, Дж.Х. и др. (2018). Отбор и проверка эталонных генов для RT-qPCR-анализа божьей коровки Henosepilachna viginioctomaculata . Фронт. Физиол. 9:1614. doi: 10.3389/Fphys.2018.01614

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Massey, J.H., Akiyama, N., Bien, T., Dreisewerd, K., Wittkopp, P.J., Yew, J.Y., et al. (2019). Плейотропные эффекты черного дерева и коричневого на пигментацию и кутикулярный углеводородный состав Drosophila melanogaster . Фронт. Физиол. 10:518. doi: 10.3389/Fphys.2019.00518

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Матуте, Д. Р., и Харрис, А. (2013). Влияние пигментации брюшка на высыхание и устойчивость к ультрафиолету у двух видов Drosophila . Эволюция 67, 2451–2460. doi: 10.1111/evo.12122

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мун, С., Но, М.Ю., Крамер, К.Дж., Мутукришнан, С.и Аракане Ю. (2020). Функции гена в пигментации кутикулы взрослого желтого мучного червя Tenebrio molitor . Биохимия насекомых. Мол. биол. 117:103291. doi: 10.1016/J.Ibmb.2019.103291

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Но, М.Ю., Ку, Б., Крамер, К.Дж., Мутукришнан, С., и Аракане, Ю. (2016). Ген арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы 1 (TcAANAT1) необходим для морфологии кутикулы и пигментации взрослого красного мучного жука, Tribolium castaneum . Биохимия насекомых. Мол. биол. 79, 119–129. doi: 10.1016/j.ibmb.2016.10.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Филлипс А.М., Смарт Р., Штраус Р., Брембс Б. и Келли Л.Е. (2005). Загадка Drosophila black: молекулярная характеристика мутанта black1 и поведенческого аллеля. Ген 351, 131–142. doi: 10.1016/j.gene.2005.03.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Розленд, К.Р., Крамер, К.Дж., и Хопкинс, Т.Л. (1987). Прочность кутикулы и пигментация ржаво-красных и черных штаммов Tribolium castaneum : корреляция с содержанием катехоламинов и β-аланина. Биохимия насекомых. 17, 21–28. дои: 10.1016/0020-1790(87)

-9

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Саймон, Дж. Д., Пелеш, Д., Вакамацу, К., и Ито, С. (2009). Текущие проблемы в понимании меланогенеза: соединение химии, биологического контроля, морфологии и функции. Пигм. Клеточная меланома R. 22, 563–579. doi: 10.1111/j.1755-148X.2009.00610.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Телонис-Скотт, М., и Хоффманн, А.А. (2018). Усиление черного дерева? общие ассоциации с цис-регуляторным гаплотипом для пигментации грудной клетки Drosophila melanogaster у населения Японии и населения Австралии. Фронт. Физиол. 9:822. doi: 10.3389/Fphys.2018.00822

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Телонис-Скотт, М., Хоффманн, А.А., и Сгро, К.М. (2011). Молекулярная генетика клинальной изменчивости: тематическое исследование пигментации черного дерева и грудного трезубца у Drosophila melanogaster из восточной Австралии. Мол. Экол. 20, 21:00–21:10. doi: 10.1111/j.1365-294X.2011.05089.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Томоясу, Ю., Аракане, Ю., Крамер, К.Дж., и Денелл, Р.Е. (2009). Повторяющиеся варианты формирования экзоскелета во время эволюции от крыла к надкрылью у жуков. Курс. биол. 19, 2057–2065 гг. doi: 10.1016/j.cub.2009.11.014

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

True, JR (2003). Меланизм насекомых: молекулы имеют значение. Тренды Экол. Эвол. 18, 640–647. doi: 10.1016/j.tree.2003.09.006

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

True, J.R., Yeh, S.D., Hovemann, B.T., Kemme, T., Meinertzhagen, I.A., Edwards, T.N., et al. (2005). Drosophila tan кодирует новую гидролазу, необходимую для пигментации и зрения. Генетика PLoS. 1:e63. doi: 10.1371/journal.pgen.0010063

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вант Хоф А. Э., Эдмондс Н., Даликова М., Марек Ф. и Саккери И. Дж. (2011). Промышленный меланизм британской перечной бабочки имеет уникальное и недавнее мутационное происхождение. Наука 332, 958–960. doi: 10.1126/science.1203043

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ваппнер, П., Хопкинс, Т. Л., Kramer, K.J., Cladera, J.L., Manso, F., and QuesadaAllue, L.A. (1996a). Роль катехоламинов и β-аланина в окраске куколок дикого типа и меланических мутантов средиземноморской плодовой мухи ( Ceratitis capitata ). J. Физиология насекомых. 42, 455–461. дои: 10.1016/0022-1910(95)00131-X

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Wappner, P., Kramer, K.J., Manso, F., Hopkins, T.L., and QuesadaAllue, L.A. (1996b). Метаболизм N-β-аланилдоамина для пупариального дубления у дикого типа и мутантных штаммов Niger средиземноморской плодовой мухи, Ceratitis capitata . Биохимия насекомых. Мол. биол. 26, 585–592. doi: 10.1016/S0965-1748(96)00012-4

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Виткопп, П.Дж., и Белдаде, П. (2009). Развитие и эволюция пигментации насекомых: генетические механизмы и возможные последствия плейотропии. Семин. Сотовый Дев. биол. 20, 65–71. doi: 10.1016/j.semcdb.2008.10.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Виткопп, П.Дж., Кэрролл, С.Б. и Копп А. (2003). Эволюция в черно-белом изображении: генетический контроль пигментных пятен у дрозофилы . Тенденции Жене. 19, 495–504. doi: 10.1016/S0168-9525(03)00194-X

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Райт, TRF (1987). Генетика метаболизма биогенных аминов, склеротизации и меланизации у Drosophila melanogaster . Доп. Жене. 24, 127–222. doi: 10.1016/s0065-2660(08)60008-5

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Сюй, П., Ze, L.J., Kang, W.N., Wu, J.J., Jin, L., Anjum, A.A., et al. (2020). С помощью РНК-интерференции выявлена ​​функциональная дивергенция генов white у Henosepilachna vigintioctopunctata . Насекомое Мол. биол. 29, 466–476. doi: 10.1111/imb.12656

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ze, L.J., Xu, P., Kang, W.N., Wu, J.J., Jin, L., Anjum, A.A., et al. (2021). Нарушение кинуренинового пути указывает на физиологическое значение катаболизма триптофана у Henosepilachna vigintioctopunctata . Аминокислоты 53, 1091–1104. doi: 10.1007/s00726-021-03009-4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Zhan, S., Guo, Q., Li, M., Li, M., Li, J., Miao, X., et al. (2010). Нарушение гена N-ацетилтрансферазы у тутового шелкопряда раскрывает новую роль в пигментации. Разработка 137, 4083–4090. doi: 10.1242/dev.053678

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан, К. Л., Ван, Ф., Го, Дж., Deng, X.Y., Chen, J.Y., and Lin, L.B. (2018). Характеристика транскриптомов божьей коровки Henosepilachna vigintioctopunctata на разных этапах жизни. Науч. Данные 5:180093. doi: 10.1038/Sdata.2018.93

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Циглер, А.Б., Брюссельбах, Ф., и Ховеманн, Б.Т. (2013). Активность и коэкспрессия Drosophila black с черным деревом в оптических долях мух выявляет предполагаемые совместные задачи в зрении, которые избегают электроретинографического обнаружения. Дж. Комп. Нейрол. 521, 1207–1224. doi: 10.1002/cne.23247

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Утолщение кутикулы у устойчивого к пиретроидам штамма обыкновенного постельного клопа Cimex lectularius L. (Hemiptera: Cimicidae)

Abstract

Утолщение покровов как механизм устойчивости к инсектицидам является хорошо известным явлением в мире насекомых и в последнее время было обнаружено у насекомых, проявляющих устойчивость к пиретроидам.Устойчивость к пиретроидным инсектицидам обыкновенного постельного клопа Cimex lectularius L. широко распространена и часто рассматривается как причина повторного появления вредителя. Сверхэкспрессия белков, откладывающих кутикулу, была продемонстрирована у устойчивых к пиретроидам постельных клопов, хотя до настоящего времени не проводилось морфологического анализа кутикулы для подтверждения фенотипической связи. В этой статье описывается исследование толщины кутикулы полевого штамма с высокой устойчивостью к пиретроидам, собранного в Сиднее, Австралия, в ответ на время до нокдауна при принудительном воздействии пиретроидного инсектицида.Средняя толщина кутикулы положительно коррелировала со временем до нокдауна, при этом наблюдались значительные различия между клопами, у которых нокдаун был сбит через 2 часа, 4 часа, и теми, которые еще не пострадали через 24 часа. Дальнейший анализ также показал, что выжившие в течение 24 часов обладали статистически значимо более толстой кутикулой по сравнению с чувствительным к пиретроидам штаммом C . лектулариус . Это исследование демонстрирует, что утолщение кутикулы присутствует в пиретроид-резистентном штамме C . lectularius , и что даже у стабильно устойчивого штамма толщина кутикулы будет варьироваться в зависимости от времени до нокдауна при воздействии инсектицида. Таким образом, эту реакцию следует учитывать в будущих исследованиях кутикулы устойчивых к инсектицидам постельных клопов и, возможно, других насекомых.

Образец цитирования: Lilly DG, Latham SL, Webb CE, Doggett SL (2016) Утолщение кутикулы у устойчивого к пиретроидам штамма обыкновенного постельного клопа, Cimex lectularius L.(Полужесткокрылые: Cimicidae). ПЛОС ОДИН 11(4): e0153302. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153302

Редактор: Джон Вонтас, Критский университет, ГРЕЦИЯ

Получено: 2 ноября 2015 г.; Принято: 9 марта 2016 г.; Опубликовано: 13 апреля 2016 г.

Авторское право: © 2016 Lilly et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все файлы данных доступны в базе данных figshare (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.2788684.v1).

Финансирование: Исследование в значительной степени финансировалось Австралийской премией для аспирантов Департамента промышленности, инноваций, науки, исследований и высшего образования правительства Австралии и администрировалось Сиднейским университетом в качестве студенческой стипендии. Частичное финансирование в виде отраслевого гранта для аспирантов было получено от Bayer CropScience Pty Ltd, Австралия (www.bayercropscience.com.au) и находился в ведении Сиднейского университета. DGL получила частичное финансирование от Bayer CropScience Pty Ltd. DGL, CEW и SLD бесплатно получили инсектицид для использования в этом исследовании от Syngenta Crop Protection Pty Limited. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы ознакомились с политикой журнала и имеют следующие конкурирующие интересы: DGL получила частичное финансирование от Bayer CropScience Pty Ltd.DGL, CEW и SLD бесплатно получили инсектицид для использования в этом исследовании от Syngenta Crop Protection Pty Limited. Это не повлияло на приверженность авторов политике PLOS ONE в отношении обмена данными и материалами.

Введение

С начала века во многих странах произошло резкое возрождение числа инвазий постельных клопов, как обычных, Cimex lectularius L., так и тропических Cimex hemipterus F. [1]. ].Резистентность к инсектицидам обычно считается ключевым фактором возрождения постельных клопов [1–5], поскольку было обнаружено, что устойчивость к пиретроидам широко распространена одновременно с ростом и распространением инвазий [4, 6–16]. Было обнаружено несколько механизмов, способствующих наблюдаемой резистентности, в том числе мутации kdr -типа белка в сайте-мишени [8, 9, 15, 16], сверхэкспрессия детоксицирующих ферментов [15, 17] и снижение проникновения [11, 18]. ].

Известно, что снижение проникновения других устойчивых к инсектицидам насекомых является механизмом устойчивости, поскольку он был впервые установлен в 1960-х годах с пиретрином [19], фосфорорганическими соединениями [20–22], карбаматами [23, 24] и хлорорганическими соединениями [25–25]. 28] .90–290 Это может происходить с помощью нескольких механизмов, включая усиленную экспрессию механизмов метаболической резистентности в кожных покровах [18], повышенное присутствие связывающих белков, липидов и/или склеротизацию, которые улавливают инсектициды [29, 30], значительно более толстую кутикулу [31 , 32], или сочетание некоторых или всех этих механизмов вместе [30, 33–35]. Некоторые из этих механизмов были обнаружены у постельных клопов, за исключением утолщения кутикулы.

Обычно снижение проникновения само по себе не обеспечивает высокой степени устойчивости [25, 33, 36], хотя, тем не менее, оно может иметь значение, придавая уровень перекрестной устойчивости более широкому кругу инсектицидов [25, 33, 37], повышения эффективности метаболической детоксикации [26, 38–40] или отсрочки наступления нокдауна [25, 32, 41].Однако экспрессия одного или нескольких механизмов резистентности не обязательно предопределяет соответствующее изменение экспрессии кутикулярных белков [42], хотя, по-видимому, наоборот, снижение пенетрации обычно обнаруживается только при наличии других механизмов [32, 43–45]. .

До настоящего времени не проводилось поддающихся измерению сравнений толщины кутикулы постельных клопов, хотя результаты недавнего молекулярного анализа нескольких C . lectularius указывают на изменение экспрессии белка [11, 39].Проявление и усиление других механизмов резистентности в кутикуле убедительно свидетельствует о снижении проникновения и/или утолщении кутикулы [18], и совсем недавно это было успешно установлено у южноафриканского комара-переносчика малярии Anopheles funestus [32]. Таким образом, при адаптации схемы эксперимента, использованной с Anopheles funestus , целью данной статьи является исследование потенциального наличия утолщения кутикулы у штамма C с высокой устойчивостью к пиретроидам. lectularius , а также изучить связь любого такого утолщения со временем нокдауна при воздействии инсектицида.

Экспериментальные методы

Химические вещества

Инсектицид

Demand ® (25 г/л лямбда-цигалотрина) был поставлен бесплатно компанией Syngenta Crop Protection Pty Limited (Level 1, 2–4 Lyonpark Road, Macquarie Park NSW 2113).

Штаммы постельных клопов

Хранение и культивирование штаммов постельных клопов проводились в соответствии с одобрением Комитета по этике животных больницы Вестмид (Протокол WHAEC №2002 г.) и в соответствии с Руководством по содержанию крыс в научных учреждениях Группы экспертов по исследованиям на животных штата Новый Южный Уэльс (ARRP).

Cimex lectularius образцов были собраны в ходе одного домашнего полевого заражения в пригороде Парраматта, Новый Южный Уэльс, Австралия, в декабре 2012 г. Подробная история обработки этого штамма недоступна, хотя считается, что контроль над инсектицидами предпринимались попытки до его сбора. Образцы исследовали на наличие видов [46] гаплотипа kdr [8] и затем использовали для создания колонии в ведомственной инсектарии, поддерживаемой при 25°C (±1°C) и относительной влажности 75% (±10%). с фотопериодом 12:12 (Д:Д) ч [12].Всем постельным клопам предлагали кровяную муку на анестезированных крысах, свободных от специфических патогенов (SPF), за семь дней до отбора для использования в биологических анализах. Анестезию крыс достигали внутрибрюшинной инъекцией кетамина и ксилазина, а восстановление контролировали до полного. Выбор инсектицидов не проводился. Профилирование устойчивости показало, что этот штамм гомогенно обладал гаплотипом B (только L925I) kdr -типа устойчивости [8]. Воздействие экспресс-анализа поля резистентности на основе d-аллетрина также не выявило каких-либо статистически значимых уровней нокдауна [47].Учитывая отсутствие эффективности d-аллетрина (пиретроид I типа первого поколения), для использования в качестве скринингового агента в этом исследовании был предпочтительно выбран пиретроид II типа второго поколения, лямбда-цигалотрин.

Дополнительный лабораторный штамм C . lectularius , хранившийся в колониях с 1960-х годов с известной чувствительностью к пиретроидам (обозначенный как штамм «Monheim» [12]), также выборочно использовался для оценки какого-либо эффекта из-за различий в размерах тела насекомых.У штамма Monheim отсутствуют какие-либо мутации типа kdr (гаплотип А) [8].

Чтобы гарантировать, что все жуки, используемые в экспериментах, были одного возраста, когорты жуков пятого возраста были изолированы от исходных колоний, скармливались до насыщения и ежедневно контролировались на предмет появления взрослых особей. После созревания жуков сразу же разделяли по полу, чтобы ограничить возможность размножения, и выдерживали еще 8 или 9 дней (в зависимости от их предполагаемого использования) без какой-либо дополнительной кровяной муки.

Биоанализ с нокдауном

Раствор инсектицида Demand с концентрацией 20 мл/л был смешан в соответствии с указаниями на этикетке и применен из расчета 1.2 мл (до стекания) на 90 мм Whatman Качественная фильтровальная бумага № 1 (кат. № 1001–090), выдержанная в чашках Петри. Шестнадцать повторов 10 самцов постельных клопов Parramatta штамма 9-дневного возраста были затем немедленно помещены на обработанную поверхность (без периода высыхания) и нокдаун был зарегистрирован с 10-минутными интервалами до 4 часов. Нокдаун был определен как неспособность жуков выпрямиться при переворачивании на спинную сторону. Пораженных клопов немедленно переносили в маркированные флаконы с образцами, содержащие 70% этанола.Постельные клопы, которые были уничтожены в течение первых 2 часов, были отмечены как «нетерпимые» группы, а незатронутые клопы через 4 часа были отмечены как «толерантные». Эксперимент повторялся до тех пор, пока не было собрано не менее 10 ошибок для каждой группы ответов.

Чтобы контролировать дополнительное время, необходимое для отбора наиболее устойчивых постельных клопов, описанный выше эксперимент был повторен с группой 8-дневных самцов клопов штамма Parramatta, и эксперимент (9 повторов по 10 клопов) позволил запустить на 24 часа непрерывного принудительного воздействия.Любые постельные клопы, не подвергшиеся воздействию по истечении 24 часов, были затем отмечены как «устойчивые» группы, и, таким образом, на момент отбора проб им было 9 дней в соответствии с «нетерпимыми» и «толерантными» ответными группами.

Была предпринята попытка подвергнуть клопов штамма Monheim вышеуказанному режиму, однако все клопы быстро погибли от инсектицида в течение одного 10-минутного периода, и, таким образом, разделение на группы с различной переносимостью было невозможно. Следовательно, штамм Monheim был исключен из межгруппового анализа толщины кутикулы и времени до нокдауна, но, тем не менее, случайная выборка 9-дневных насекомых была обработана для измерения кутикулы, чтобы обеспечить сравнение между «чувствительными» и «устойчивые» ошибки.

Подготовка к сканирующему электронному микроскопу

Образцы, консервированные в 70% этаноле, исследовали под препаровальным микроскопом в свежем 70% этаноле. Средние ноги каждого экземпляра отделяли от тела в апикальной области бедренной кости. Последующий разрез был сделан в середине большеберцовой кости, в то время как ноги были подвешены в небольшой капле 70% этанола. Остальные тела образцов хранили в 70% этаноле для последующего анализа. Ноги переносили в пробирки Эппендорфа, еще дважды промывали в 70% этаноле для удаления остатков срезов и обрабатывали в восходящей серии этанола следующим образом: 80%, 90%, 95% и 100%, дважды по 5 минут каждый, с последующими 3 промывками. по 10 минут в ультрачистом этаноле.Образцы были химически высушены в течение 3 минут в гексаметилдисилазане (Proscitech), перенесены в новые пробирки Эппендорфа и высушены на воздухе в течение 5 минут. Заглушки образцов SEM (Ted Pella) были модифицированы алмазной пилой, чтобы обнажить плоскую поверхность. Ноги были прикреплены к этой поверхности с помощью углеродной ленты и аккуратно установлены, чтобы убедиться, что большеберцовая кость находится в вертикальном положении, а отрезанная средняя точка была открыта на апикальной поверхности заглушки. Углеродная краска была нанесена для закрепления образцов на заглушках образцов. Образцы напыляли золотом в течение 2 минут при 25 мА с помощью EMITECH K550X и хранили в эксикаторе.

Электронно-микроскопическая визуализация

Вторичные электронные микрофотографии были получены с помощью Zeiss EVO 50 SEM при 10 кВ. Каждый образец отдельно поворачивали и наклоняли к детектору вторичных электронов, изменяя рабочее расстояние от 9 до 25 мм. Калибровка фокуса изображения и масштаба была скорректирована с помощью инструментов коррекции динамического фокуса и наклона. Встроенное усреднение линий использовалось для минимизации артефактов зарядки во время получения изображения.

Анализ изображения

Необработанные и обработанные изображения были проанализированы в ImageJ (версия 1.46р) [48]. Для оценки ширины кутикулы известный масштаб в микронах из обработанного изображения был измерен в соответствии с количеством пикселей, и это значение было перенесено на необработанное изображение. После этого было проведено 12 точечных измерений примерно на одинаковом расстоянии от самых внешних до самых внутренних видимых участков кутикулы, избегая при этом очевидных остатков, повреждений или слоев щетинок (рис. 1). Измерения различных образцов были выполнены вслепую для выделенной группы ответов («нетерпимые», «толерантные», «резистентные» и «восприимчивые»), чтобы ограничить возможность систематической ошибки.

Рис. 1. Поперечный срез средней голени средней ноги Cimex lectularius (штамм Parramatta) и пример методологии измерения кутикулы двенадцатью точками.

Буквы обозначают размеры: a = 9,15 мкм, b = 9,82 мкм, c = 10,25 мкм, d = 7,91 мкм, e = 7,16 мкм, f = 8,42 мкм, g = 8,02 мкм, h = 8,41 мкм, k = 10,12 мкм, m = 8,82 мкм, n = 8,31 мкм, o = 8,09 мкм [i, j и l не включены для удобства чтения].

https://doi.org/10.1371/журнал.pone.0153302.g001

Размер выборки был уравновешен случайным отбором в IBM SPSS Statistic v22 для Mac (IBM Corp., 2013) со средними значениями толщины кутикулы трех групп ответа Парраматта, сравненными с помощью однофакторного дисперсионного анализа и метода наименьшей значимой разницы Фишера. (LSD) апостериорные тесты. Толщину кутикулы в зависимости от времени до нокдауна анализировали с помощью линейной регрессии. Толщину кутикулы между «восприимчивыми» и «устойчивыми» жуками сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа.

Размеры тела насекомых

Дополнительные измерения тела были сделаны для образцов из всех четырех ответивших групп, использованных для анализа кутикулы, чтобы проверить влияние различных размеров тела или придатков на полученные средние значения кутикулы.Некоторые целевые измерения были адаптированы из ранее опубликованных исследований [49] и включали ширину переднеспинки ( pw ), длину переднеспинки ( pl ), ширину головы ( hw ), длину 1 st антенного сегмента ( после скапуса – a2l ), длина голени задней ноги ( t3l ) и ширина голени задней ноги ( t3w ). Измерения проводились под препаровальным микроскопом с использованием предметного столика и/или оптических микрометров и оценивались на предмет статистической значимости и величины эффекта (частичные значения Eta 2 ) с использованием многомерного анализа общей линейной модели и апостериорных сравнений Бонферрони.

Результаты

Нокдаун

Нокдаун подвергшихся воздействию 9-дневных постельных клопов штамма Parramatta происходил асимптотически до значения примерно 76% (SE ± 1,8%) в течение 4 часов, при этом первые клопы поражались через 50 минут (рис. 2). и увеличение до 38% (SE ± 6,5%) через 2 часа (произвольная конечная точка группы «непереносимого» ответа). У постельных клопов в возрасте до 8 дней, постоянно подвергавшихся принудительному воздействию в течение 24 часов (до эквивалентного возраста 9 дней), нокдаун составил 82% (S.E. ± 2,0%), оставив еще 18% ошибок, которые не были затронуты и впоследствии классифицированы как «устойчивые» группы.

Визуализация и толщина кутикулы

Несколько образцов пришлось исключить из анализа на этапе визуализации в первую очередь из-за повреждения, которое произошло во время разрезания и монтажа, или в результате того, что внутренние ткани закрыли кутикулу. В тех случаях, когда это влияло на общий паритет размера выборки, избыточные образцы исключались путем случайной выборки в SPSS, так что в конечном итоге в каждой ответившей группе анализировались измерения 10 образцов.

Было обнаружено, что средняя толщина кутикулы значительно различается (p < 0,001) между тремя группами, реагирующими на штамм Parramatta (рис. 3). «Устойчивые» постельные клопы имели среднюю толщину кутикулы 10,13 мкм (SE ± 0,15 мкм), «толерантные» клопы — 9,51 мкм (SE ± 0,26 мкм) и «нетерпимые» клопы — 8,73 мкм (SE ± 0,18 мкм). Таким образом, «устойчивые» клопы имели значительно отличающуюся среднюю толщину кутикулы +0,62 мкм и +1,4 мкм по сравнению с «толерантными» (p < 0,38) и «нетолерантными» (p < 0,001) клопами соответственно, а «толерантные» клопы были также обнаружено, что средняя толщина кутикулы значительно отличается от +0.78 мкм по сравнению с «нетерпимыми» клопами (p < 0,012). Линейный регрессионный анализ времени до нокдауна и средней толщины кутикулы (рис. 4) выявил значительную тенденцию (p < 0,01), при этом толщина кутикулы положительно коррелировала (R 2 с поправкой = 0,337) с увеличением времени до нокдауна. Учитывая относительно ограниченные размеры выборки и продолжительность между временными интервалами, в остальном скромное скорректированное значение R 2 является в контексте достоверным результатом.

Рис. 3. Средняя толщина кутикулы (мкм ± S.Д) нетолерантной (n = 10), толерантной (n = 10) и резистентной (n = 10) группы ответа штамм Parramatta Cimex lectularius .

Звездочки (*) указывают на статистическую значимость (p < 0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153302.g003

Рис. 4. Положительная корреляция времени до нокдауна со средней толщиной кутикулы штамма Parramatta Cimex lectularius (n = 10 на группу ответа) после постоянное принудительное воздействие влажных остатков 20 мл/л инсектицида спроса ® (25 г/л лямбда-цигалотрина).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153302.g004

Измерения насекомых

Внутри штамма Parramatta между тремя респондентами не было статистически значимых различий по всем различным измерениям тела (ширина переднеспинки, длина переднеспинки, ширина головы, длина сегмента усика 1 st , длина голени задней ноги, ширина голени задней ноги и отношение ширины большеберцовой кости к толщине кутикулы), за исключением толщины кутикулы, как указано отдельно выше.

Было обнаружено, что

клопы штамма Monheim, чувствительные к пиретроиду, статистически значимо крупнее клопов штамма Parramatta по ширине переднеспинки (все группы p < 0,001), длине переднеспинки («нетолерантные» p < 0,002; «толерантные» p = 0,042), ширине головы. (все группы p < 0,001), длину усиков (все группы p < 0,002) и длину голени (все группы p < 0,002). Статистически значимых различий по ширине голени (во всех группах р > 0,05) и длине переднеспинки («устойчивый» р > 0.05) не наблюдалось.05).

Ранее ширина головы в C . Было установлено, что lectularius коррелирует как с различиями в размерах особей между штаммами, так и с различиями в конечностях тела относительно общего размера тела [49]. В этом исследовании изучение значений Partial Eta 2 (скорректированных) аналогичным образом показало, что и ширина переднеспинки (0,730), и ширина головы (0,759) также были важными факторами при учете доли дисперсии, связанной с каждым из измеренных аспектов.Следовательно, ширина головы была выбрана как наиболее подходящая характеристика для коррекции различий в размерах между штаммами постельных клопов Monheim и Parramatta, чтобы провести соответствующее сравнение средней толщины кутикулы. В связи с этим наблюдаемая разница в средней ширине головы между клопами штамма Monheim и «резистентной» группы Parramatta составила +9,9%. Когда эта разница в размере штамма корректируется и учитывается при сравнении толщины кутикулы, «устойчивые» клопы имеют существенное различие (p < 0.001) средняя толщина кутикулы +1,35 мкм по сравнению с «восприимчивыми» клопами (рис. 5).

Обсуждение

Устойчивость к инсектицидам представляет собой генетическое изменение в ответ на отбор токсикантами, который ухудшает контроль в полевых условиях [50] и считается естественным эволюционным ответом на антропогенный экологический стресс [33, 51–53]. В случае с постельными клопами это будет означать провал попыток борьбы с вредителями, направленных на искоренение заражения с помощью инсектицидных средств. Развитие или укрепление кутикулы в качестве основного барьера для инсектицидов является неотъемлемой частью этого процесса с очевидным преимуществом (в отсутствие каких-либо других затрат на приспособляемость), придаваемым фенотипу постельных клопов более высокой устойчивостью к принудительному воздействию инсектицидов.Использование хорошо зарекомендовавшего себя метода определения времени нокдауна позволяет идентифицировать и отделять клопов с разной устойчивостью к инсектицидам. В этом исследовании было обнаружено, что наиболее устойчивые постельные клопы (сами выделенные из высокоустойчивого полевого штамма) имеют толщину кутикулы на 16% больше, чем у наименее устойчивых («нетерпимых») клопов, и на 6,5% больше, чем у промежуточно устойчивых («толерантных») клопов. ошибки. Дальнейший анализ (после поправки на разницу в размерах штаммов) показал, что «устойчивые» жуки обладают толщиной кутикулы 15.на 3% больше, чем у восприимчивого штамма, что подтверждает связь между увеличенной толщиной кутикулы и наблюдаемой устойчивостью к инсектицидам.

В нормальных полевых условиях можно ожидать, что некоторые вариации фенотипа кутикулы внутри штамма могут быть связаны с такими факторами, как диета или возраст. Тем не менее, как диета, так и возраст контролировались до принудительного отбора клопов на основе исследований, которые показали, что постельные клопы обладают заметной устойчивостью и демонстрируют стабильный метаболизм через 9 дней [54, 55], и что никакой разницы в эффективности не наблюдалось. независимо от того, были ли баги подпитаны ранее (т.грамм. в 1-й день) или голодали до 9 дней [56]. Это согласуется с практикой других лабораторий, использующих постельных клопов в биологических анализах на основе инсектицидов, при этом наиболее избирательно используют самцов постельных клопов, стареющих в течение 7–10 дней после появления и не питающихся в течение 5–8 дней до эксперимента(ов). если вообще [6, 11, 13, 57–59].

В этом исследовании была установлена ​​разница в толщине кутикулы между штаммами с различной чувствительностью к инсектицидам после внесения поправок на увеличение размера восприимчивого штамма по сравнению с устойчивым штаммом.Учитывая, что постельные клопы линии Monheim оказались крупнее клопов линии Parramatta по целому ряду физических признаков (ширина переднеспинки, длина переднеспинки, ширина головы, длина усиков и длина голени), очевидно, что общий размер насекомого является фактором, следует учитывать в любых будущих исследованиях, направленных на изучение морфологических признаков, если изучается более одного полевого штамма. Использование морфологических признаков и, в частности, измерение ширины головы, использовалось для анализа эволюционных аспектов постельных клопов [49], и наши результаты показывают, что аналогичный подход может быть оправдан при изучении других физических механизмов, которые могут обеспечивать снижение восприимчивости к инсектицидам у C . . лектулариус .

Утолщение кутикулы у резистентных постельных клопов может иметь важные последствия для полевой борьбы, поскольку доставка инсектицидов становится потенциально менее эффективной. Однако может потребоваться дальнейшее изучение слоев кутикулы, относительного вклада каждого из них в общую толщину, а также процесса развития и отложения кутикулы у резистентных постельных клопов, чтобы понять, в какой степени утолщение кутикулы снижает проникновение (либо само по себе или путем усиления с помощью других механизмов устойчивости).Это, в свою очередь, может повлиять на усовершенствование инсектицидов и составов, направленных на преодоление повышенной толерантности постельных клопов. В идеале это исследование должно быть повторено с большим количеством полевых штаммов как обыкновенных, так и тропических видов постельных клопов, однако высокая стоимость исследования СЭМ (в настоящее время 5000 долларов США за штамм) была ограничивающим фактором в этом исследовании. Тем не менее, продолжается дальнейшая работа по полному изучению других механизмов резистентности в этом и других полевых штаммах из Австралии.

Выводы. восприимчивый штамм. Это может помочь объяснить, почему неудачи в борьбе с полевыми заражениями так распространены, и еще раз подчеркивает необходимость комплексного подхода к борьбе с постельными клопами для предотвращения дальнейшего распространения высокорезистентных насекомых.Изменения толщины кутикулы, состава липидов и проникновения инсектицидов в сочетании с экспрессией детоксицирующих ферментов или нечувствительностью целевого участка также могут иметь важные последствия для использования рецептурных инсектицидов для полевой борьбы с постельными клопами.

Благодарности

Хранение и культивирование штаммов постельных клопов проводилось в соответствии с одобрением Комитета по этике животных больницы Вестмид (Протокол WHAEC № 2002) и в соответствии с Руководством по исследованию животных штата Новый Южный Уэльс (ARRP) по содержанию крыс в научных учреждениях . .Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников отделения ухода за животными больницы Вестмид и отделения медицинской энтомологии за их помощь в обслуживании колонии. Авторы выражают признательность за средства и научно-техническую помощь, оказанную Навиной Гокулпарсад и Дженни Уайтинг из Австралийского исследовательского центра микроскопии и микроанализа в Австралийском центре микроскопии и микроанализа Сиднейского университета.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: DGL SLL CEW SLD.Проведены эксперименты: DGL SLL. Проанализированы данные: DGL. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: DGL SLL. Написал статью: DGL SLL CEW SLD.

Каталожные номера

  1. 1. Доггет С.Л., Дуайер Д.Е., Пенас П.Ф., Рассел Р.К. Постельные клопы: клиническая значимость и способы борьбы. Clin Microbiol Rev. 2012; 25(1): 164–192. пмид:22232375
  2. 2. Доггетт С.Л., Гири М.Дж., Рассел Р.С. Возрождение постельных клопов в Австралии: с заметками об их экологии и борьбе с ними.Здоровье окружающей среды. 2004 г.; 4(2): 30–38.
  3. 3. Мьямба Дж., Максвелл К.А., Асиди А., Кертис С.Ф. Устойчивость тропических клопов к пиретроидам, Cimex hemipterus , связана с использованием обработанных надкроватных сеток. Мед Вет Энтомол. 2002 г.; 16(4): 448–451. пмид:12510899
  4. 4. Ромеро А., Поттер М.Ф., Поттер Д.А., Хейнс К.Ф. Устойчивость постельного клопа к инсектицидам: фактор внезапного возрождения вредителя? J Med Entomol. 2007 г.; 44(2): 175–178. пмид:17427684
  5. 5. Ван С.Л., Купер Р.А.Экологически безопасные решения для борьбы с постельными клопами. В: Dhang P, редактор. Борьба с городскими вредителями: экологическая перспектива. Оксон, Великобритания и Кембридж, США: CABI; 2011. с. 44–63.
  6. 6. Адельман З.Н., Килкуллен К.А., Коганемару Р., Андерсон М.А.Э., Андерсон Т.Д., Миллер Д.М. Глубокое секвенирование устойчивых к пиретроидам постельных клопов выявило несколько механизмов устойчивости в пределах одной популяции. ПЛОС ОДИН. 2011 г.; 6(10): e26228. пмид:22039447
  7. 7. Боас СиДжей, Смолл Джи, Нейлор Р.Промежуточный отчет о статусе восприимчивости к инсектицидам клопов в Великобритании. Профессиональный дезинсектор. 2006 г.; Лето: 6–7.
  8. 8. Данг К., Той К.С., Лилли Д.Г., Бу В., Доггетт С.Л. Обнаружение мутаций устойчивости к нокдауну ( kdr ) у обыкновенного постельного клопа Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) в Австралии. Pest Manag Sci. 2015 г.; 71(7): 914–922. пмид:25046700
  9. 9. Данг К., Той С.С., Лилли Д.Г., Ли С.И., Нейлор Р., Тавацин А. и др. Идентификация предполагаемых мутаций kdr у тропического постельного клопа Cimex hemipterus (Hemiptera: Cimicidae).Pest Manag Sci. 2014; 71 (7): 1015–1020. пмид:25132449
  10. 10. Килпинен О., Кристенсен М., Вагн Йенсен К.М. Различия в устойчивости между хлорпирифосом и синтетическими пиретроидами у популяции Cimex lectularius из Дании. Паразитол рез. 2011 г.; 109 (5): 1461–1464. пмид:21626157
  11. 11. Коганемару Р., Миллер Д.М., Адельман З.Н. Надежная резистентность к проникновению через кутикулу у обыкновенного постельного клопа ( Cimex lectularius L.) коррелирует с повышенными стационарными уровнями транскриптов генов белков кутикулы CPR-типа.Пестик Биохим Физиол. 2013; 106(3): 190–197.
  12. 12. Лилли Д.Г., Zalucki MP, Orton CJ, Russell RC, Webb CE, Doggett SL. Подтверждение устойчивости к инсектицидам Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) в Австралии. Ауст Энтомол. 2015 г.; 54(1): 96–99.
  13. 13. Мур Д.Дж., Миллер Д.М. Лабораторные оценки эффективности инсектицидов для борьбы с Cimex lectularius . Дж Экон Энтомол. 2006 г.; 99(6): 2080–2086. пмид:17195676
  14. 14.Тавацин А., Тавара У., Чомпусри Дж., Фусуп Ю., Джонджанг Н., Кхумсавадс С. и др. Устойчивость к клопам к инсектицидам в Таиланде и лабораторная оценка инсектицидов для борьбы с Cimex hemipterus и Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae). J Med Entomol. 2011 г.; 48(5): 1023–1030. пмид:21936321
  15. 15. Юн К.С., Квон Д.Х., Стричарц Дж.П., Холлингсворт К.С., Ли С.Х., Кларк Дж.М. Биохимический и молекулярный анализ устойчивости к дельтаметрину обыкновенного постельного клопа (Hemiptera: Cimicidae).J Med Entomol. 2008 г.; 45 (6): 1092–1101. пмид:134
  16. 16. Чжу Ф., Виггинтон Дж., Ромеро А., Мур А., Фергюсон К., Палли Р. и др. Широкое распространение мутаций устойчивости к нокдауну у постельного клопа Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae), популяции в США. Arch Insect Biochem Physiol. 2010 г.; 73(4): 245–257. пмид:20301216
  17. 17. Чжу Ф., Сэмс С., Моурал Т., Хейнс К.Ф., Поттер М.Ф., Палли С.Р. РНК-интерференция НАДФН-цитохром Р450 редуктазы приводит к снижению устойчивости к инсектицидам постельного клопа Cimex lectularius .ПЛОС ОДИН. 2012 г.; 7(2): 1–10.
  18. 18. Чжу Ф., Гуджар Х., Гордон Дж. Р., Хейнс К. Ф., Поттер М. Ф., Палли С. Р. Постельные клопы выработали уникальную адаптивную стратегию, позволяющую противостоять пиретроидным инсектицидам. Научный представитель 2013 г.; 3 (1456).
  19. 19. Файн Б.К., Годин П.Дж., Тейн Э.М. Проникновение пиретрина I, меченного углеродом-14, в восприимчивых и устойчивых к пиретроидам комнатных мух. Природа. 1963 год; 199 (489): 927–928.
  20. 20. Форгаш А.Дж., Райли Р.С., Кук Б.Дж. Механизмы резистентности полирезистентного диазинон-селектированного Musca domestica .Дж Экон Энтомол. 1962 год; 55(4): 544–551.
  21. 21. Мацумура Ф., Браун AWA. Биохимическое исследование толерантного к малатиону штамма Aedes aegypti . Новости Москвы 1961; 21: 192–194.
  22. 22. Мацумура Ф., Браун AWA. Исследования устойчивости к фосфорорганическим соединениям у Aedes aegypti . Новости Москвы. 1963 год; 23: 26–31.
  23. 23. McDonald IC, Cochran DG. Перекрестная устойчивость к карбамату у резистентного к карбарилам штамма немецкого таракана. Дж Экон Энтомол.1968 год; 61(3): 670–673.
  24. 24. Георгиу Г.П., Меткалф Р.Л., Март РБ. Развитие и характеристика устойчивости к карбаматным инсектицидам у комнатной мухи, Musca domestica . Дж Экон Энтомол. 1961 год; 54(1): 132–140.
  25. 25. Плапп Ф.В., Хойер Р.Ф. Устойчивость к инсектицидам у комнатной мухи: снижение скорости поглощения как механизм действия гена, который действует как усилитель устойчивости. Дж Экон Энтомол. 1968 год; 61 (5): 1298–1303. пмид:5680754
  26. 26.Савицкий Р.М., Лорд К.А. Некоторые свойства механизма задержки проникновения инсектицидов в комнатных мух. Пестическая наука. 1970 г.; 1(5): 213–217.
  27. 27. Винсон Б.С., Браззел мл. Проникновение и метаболизм C14-меченого ДДТ в устойчивых и восприимчивых личинках табачной листовертки, Heliothis virescens (F.). Дж Экон Энтомол. 1966 год; 59(3): 600–604.
  28. 28. Продавцы Л, Г., Гатри Ф.Е., Кунс Л.Б. Авторадиографические исследования всего тела по проникновению 14C-дильдрина у восприимчивых и устойчивых домашних мух.Окружающая среда Энтомол. 1973 год; 2(2): 296–298.
  29. 29. Винсон С.Б., Лоу П.К. Кутикулярный состав и устойчивость к ДДТ табачной листовертки. Дж Экон Энтомол. 1971 год; 64 (6): 1387–1390. пмид:20333836
  30. 30. Патил В.Л., Гатри Ф.Е. Изменение токсичности инсектицидов при удалении кутикулярных липидов у домашних мух. Хемосфера. 1978 год; 7(9): 707–710.
  31. 31. Висманн ВР. Untersuchungen über das physiologische verhalten von Musca domestica L. verschiedener proofienzen.Mitt Schweiz Entomol Ges. 1947 год; 20: 484–504.
  32. 32. Вуд О.Р., Ханрахан С., Кутзи М., Кукемор Л.Л., Брук Б.Д. Утолщение кутикулы, связанное с устойчивостью к пиретроидам у основного переносчика малярии Anopheles funestus . Векторы паразитов. 2010 г.; 3(67): 1–7.
  33. 33. Ю СЖ. Токсикология и биохимия инсектицидов. Нью-Йорк: CRC Press; 2008.
  34. 34. Терьер ЛК. Биохимия и токсикология инсектицидов. Университет штата Орегон: Корваллис; 1980.
  35. 35. Патил В.Л., Гатри Ф.Е. Кутикулярные липиды двух устойчивых и восприимчивых штаммов комнатных мух. Пестическая наука. 1979 год; 10(5): 399–406.
  36. 36. Gunning RV, Easton CS, Balfe ME, Ferris IG. Механизмы устойчивости к пиретроидам у австралийского Helicoverpa armigera . Пестическая наука. 1991 год; 33(4): 473–90.
  37. 37. Оппенорт Ф.Дж. Биохимия устойчивости к инсектицидам. Пестик Биохим Физиол. 1984 год; 22(2): 187–193.
  38. 38. Ахмад М., Денхолм И., Бромилов Р.Х.Замедленное проникновение через кутикулу и усиленный метаболизм дельтаметрина у устойчивых к пиретроидам штаммов Helicoverpa armigera из Китая и Пакистана. Pest Manag Sci. 2006 г.; 62(9): 805–810. пмид:16649192
  39. 39. Мамидала П., Виджератне А.Дж., Виджератне С., Корнакер К., Бабу С., Ривера-Вега Л.Дж. и др. RNA-Seq и молекулярный докинг выявили многоуровневую устойчивость постельных клопов к пестицидам. Геномика BMC. 2012 г.; 13(6): 1–16.
  40. 40. Савицкий РМ. Взаимодействие фактора, замедляющего проникновение инсектицидов, с деэтилирующим механизмом резистентности у устойчивых к фосфорорганическим соединениям комнатных мух.Пестическая наука. 1970 г.; 1(3): 84–87.
  41. 41. Скотт Дж.Г. Изучение механизмов устойчивости к инсектицидам: методы, стратегии и подводные камни. В: Roush RT, Tabashnik BE, ред. Устойчивость членистоногих к пестицидам. Нью-Йорк и Лондон: Чепмен и Холл; 1990. с. 39–57.
  42. 42. Ю С.Дж., Нгуен С.Н. Восприимчивость к инсектицидам и активность ферментов детоксикации у перметрин-отобранных мотыльков. Пестик Биохим Физиол. 1996 год; 56(1): 69–77.
  43. 43. Алехин А., Бейкер М., Мота-Санчес Д., Дивели Г., Графиус Э.Дж.Устойчивость колорадского жука к инсектицидам. Американский журнал исследований картофеля. 2008 г.; 85(6): 395–413.
  44. 44. Валлес С.М., Донг К., Бреннер Р.Дж. Механизмы, ответственные за устойчивость к циперметрину у штамма немецкого таракана Blattella germanica . Пестик Биохим Физиол. 2000 г.; 66(3): 195–205.
  45. 45. Аргентинец Дж.А., Чжу К.И., Ли С.Х., Кларк Дж.М. Биохимические механизмы устойчивости к азинфосметилу изогенных штаммов колорадского жука.Пестик Биохим Физиол. 1994 год; 48(1): 63–78.
  46. 46. Пользователь РЛ. Монография Cimicidae (Hemiptera—Heteroptera). Колледж-Парк, Мэриленд: Энтомологическое общество Америки; 1966.
  47. 47. Данг К., Лилли Д.Г., Бу В., Доггетт С.Л. Простой, быстрый и экономичный метод определения резистентности к пиретроидам у постельных клопов, Cimex spp. (Полужесткокрылые: Cimicidae). Ауст Энтомол. 2015 г.; 54(2): 191–196.
  48. 48. Расбанд В.С. ИзображениеJ. Изображение Дж.1.47в изд. Мэриленд, США: Национальный институт здоровья; 1997–2011 гг.
  49. 49. Балвин О., Манклингер П., Краточвил Л., Вилимова Дж. Митохондриальная ДНК и морфология показывают независимые эволюционные истории клопа Cimex lectularius (Heteroptera: Cimicidae) на летучих мышах и людях. Паразитол рез. 2012 г.; 111(1): 457–469. пмид:223
  50. 50. Савицкий РМ. Определение, обнаружение и документирование устойчивости к инсектицидам. Борьба с устойчивостью к ксенобиотикам: биологические и химические подходы.Чичестер, Англия: Эллис Хорвуд; 1987. с. 105.
  51. 51. Фейерайзен Р. Молекулярная биология устойчивости к инсектицидам. Токсикол Летт. 1995 год; 82–3: 83–90.
  52. 52. Хой МА. Мифы, модели и снижение устойчивости к пестицидам. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1998 год; 353 (1376): 1787–1795. пмид:10021775
  53. 53. ffrench-Constant RH, Daborn PJ, Le Goff G. Генетика и геномика устойчивости к инсектицидам. Тенденции Жене. 2004 г.; 20(3): 163–170.пмид:15036810
  54. 54. DeVries ZC, Reid WR, Kells SA, Appel AG. Влияние голодания на толерантность к дельтаметрину у постельных клопов, Cimex lectularius L. (Hemiptera: Cimicidae). Насекомые. 2015 г.; 6(1): 102–111. пмид:26463068
  55. 55. DeVries ZC, Kells SA, Appel AG. Влияние голодания и линьки на скорость метаболизма постельного клопа ( Cimex lectularius L.). Физиол Биохим Зоол. 2015 г.; 88(1): 53–65. пмид:255
  56. 56. Чоу Д, Кэмпбелл К.Влияние режима питания на реакцию смертности взрослых постельных клопов (Hemiptera: Cimicidae) на некоторые инсектициды. Дж. Экон Энтомол. 2014; 107(3): 1206–1215. пмид:25026684
  57. 57. Фельдлауфер М.Ф., Ульрих К.Р., Крамер М. Нет связанных с полом различий в смертности постельных клопов (Hemiptera: Cimicidae), подвергшихся воздействию дельтаметрина, и выжившие постельные клопы могут выздороветь. Дж. Экон Энтомол. 2013; 106(2): 988–994. пмид:23786091
  58. 58. Ромеро А., Поттер М.Ф., Хейнс К.Ф. Оценка пиперонилбутоксида как синергиста дельтаметрина для устойчивых к пиретроидам постельных клопов.Дж. Экон Энтомол. 2009 г.; 102(6): 2310–2315. пмид:20069862
  59. 59. Ромеро А., Поттер М.Ф., Хейнс К.Ф. Оценка хлорфенапира для борьбы с постельным клопом, Cimex lectularius L. Pest Manag Sci. 2010 г.; 66 (11): 1243–1248. пмид:20661938

Кутикулярный белок с последовательностью низкой сложности становится поперечно-сшитым во время склеротизации кутикулы насекомых и необходим для линьки взрослых особей вырезаны из взрослых фаратов (5-дневные куколки)

T.castaneum содержал два основных белка, TcCPR27 и TcCPR18 (рис. 1А). Эти белки содержат мотив RR-2 14,15 и присутствуют не только в дорсальной кутикуле надкрылий, но также и в кутикуле грудной и вентральной брюшины, которые становятся сильно склеротизованными и пигментированными у зрелых взрослых особей. В этом исследовании мы сосредоточились на третьем наиболее распространенном белке в экстрактах, который был идентифицирован масс-спектрометрией MALDI-TOF пептидов, полученных при обработке трипсином (белковое пятно E43 в 2D-ПААГ на рис.1 в Dittmer et al. 11 ). Мы клонировали полноразмерную кДНК этого кутикулярного белка и обозначили ее как TcCP30. кДНК TcCP30 кодирует белок, состоящий из 171 аминокислотного остатка, включая предполагаемый N-концевой сигнальный пептид секреции (рис. 1В). В зрелом белке TcCP30 отсутствует консенсусный мотив R&R. Вместо этого он имеет аминокислотную последовательность низкой сложности с очень необычным аминокислотным составом: 36% Glu, 21% His, 19% Arg и 16% Gly. Зрелый TcCP30 имеет теоретическую молекулярную массу 19.0 кДа и pI рН 5,8. Его электрофоретическая подвижность в SDS-PAGE варьируется в зависимости от состава геля и используемых буферов для электрофореза. В 15% акриламидных гелях для SDS-PAGE в трис-глициновом буфере (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 0,1 % SDS) он мигрирует с видимым размером 30 кДа (стрелка на рис. 1А). Однако при использовании градиентных гелей NuPAGE 4-12% и буфера MES кажущаяся масса TcCP30 и рекомбинантного rTcCP30 составляет ~ 25   кДа (см. Дополнительную рис. 3A). TcCP30 имеет чередующиеся блоки из 3-5 положительно или отрицательно заряженных аминокислотных остатков в центральной части белка, что может вызвать его аномальную миграцию во время SDS-PAGE, а также может способствовать самосборке в кутикуле посредством электростатических взаимодействий.Это расположение аминокислот уникально среди кутикулярных белков, описанных на сегодняшний день, но аналогичная частичная последовательность была обнаружена у гигантского северного термита, Mastotermes darwiniensis (инвентарный номер GenBank GAZE01460444.1). Это открытие предполагает, что гомологичные белки могут присутствовать у других видов насекомых (см. Дополнительный рисунок S1). TcCP30 не имеет предполагаемой вторичной структуры, что позволяет предположить, что он может быть внутренне неупорядоченным, и нет предсказанных сайтов гликозилирования. Ген TcCP30 дает начало транскрипту, полученному из одного экзона, и расположен в группе сцепления 5 гена T.castaneum геном.

Рисунок 1

Идентификация основного экстрагируемого не-RR кутикулярного белка TcCP30 в надкрыльях.

( A ) Белки, выделенные из надкрылий, вырезанных из взрослых фаратов (куколки 5-го дня), анализировали с помощью 15% SDS-PAGE. Стрелка указывает TcCP30, третий по распространенности белок с кажущейся молекулярной массой 30 кДа. Два других широко распространенных кутикулярных белка RR-2, TcCPR27 и TcCPR18, также указаны 21 . ( B ) Нуклеотидная последовательность клона полноразмерной кДНК и выведенная аминокислотная последовательность TcCP30, кодируемая этой кДНК.Подчеркивание указывает на предсказанный сигнальный пептид. Пептидная последовательность, используемая для образования антител TcCP30, выделена серым цветом. Предполагаемый сигнал полиаденилирования (ААТААА) выделен жирным шрифтом.

Экспрессия TcCP30 во время развития

Онтогенетическую картину экспрессии транскриптов TcCP30 определяли с помощью количественной ОТ-ПЦР. Транскрипты TcCP30 не обнаруживались на стадиях развития эмбриона, личинки, куколки фарата и зрелой взрослой особи (дополнительная рис.2А). Однако транскрипты гена TcCP30 резко увеличились у взрослых фаратов через пять дней после окукливания, в день выхода взрослых особей в наших условиях выращивания насекомых, и снизились вскоре после выхода (дополнительная рис. 2B). Обилие транскриптов генов TcCPR27 и TcCPR18 было самым высоким в день 4 куколки 21 , на один день раньше пика экспрессии мРНК TcCP30 . Подобно генам TcCPR27 и TcCPR18 , уровень транскрипта TcCP30 в надкрыльях был значительно выше (> 4500 раз), чем в перепончатых задних крыльях (дополнительная рис.2С) 21 . Это различие согласуется с результатами микрочипового анализа надкрылий и задних крыльев T. castaneum , о которых сообщил Dittmer et al. 11 .

РНК-интерференция (РНКи)

TcCP30

Чтобы исследовать функцию (функции) TcCP30 в T. castaneum , мы провели эксперименты с РНКи, чтобы изучить влияние сниженной экспрессии этого гена кутикулярного белка. В качестве отрицательного контроля мы использовали дцРНК для Т.castaneum Vermilion (ds TcVer ), ген, необходимый для нормальной пигментации глаз 23 . Инъекция дцРНК для TcCP30 (ds TcCP30 ) существенно снижала экспрессию гена TcCP30 как на уровне мРНК (рис. 2А), так и на уровне белка (рис. 3А, 4, 5, 6 и дополнительная рис. 4). Введение ds TcCP30 (200 нг на насекомое) личинкам поздних стадий не оказало влияния на развитие личинок, личиночно-личиночную или личиночно-куколочную линьку.Полученные куколки развивались нормально, и пигментация кутикулы куколки, включая щетинки, ловушки джина и урогомфии, была нормальной (левая панель на рис. 2В). Пигментация взрослой кутикулы головы, нижних челюстей, ног и птеростигмы задних крыльев инициировалась по графику и была видна через старую кутикулу куколки (левая панель на рис. 2B). Однако на последующую куколочно-взрослую линьку отрицательно влияли TcCP30 RNAi. Хотя аполиз и соскальзывание были очевидны, некоторые взрослые фараты (около 70%) не могли сбрасывать экзувий куколки и погибали, не подвергаясь эклозии (средняя панель на рис.2Б). Кроме того, у тех взрослых особей, которые закрылись, надкрылья были морщинистыми и разделенными, что приводило к неправильному складыванию их задних крыльев (правая панель на рис. 2B).

Рисунок 2

Фенотипы потери функции, продуцируемые РНКи для TcCP30 .

дцРНК для TcCP30 или TcVer (200 нг на насекомое) вводили личинкам на поздних стадиях развития. ( A ) Уровень нокдауна транскриптов TcCP30 анализировали с помощью ПЦР в реальном времени с использованием кДНК, приготовленной из тотальной РНК, выделенной из пулов трех 5-дневных куколок.Уровни экспрессии TcCP30 были представлены относительно уровня у контрольных насекомых, инъецированных ds TcVer . Уровни транскрипта T. castaneum рибосомного белка S6 ( TcRpS6 ) измеряли для нормализации различий в концентрации матриц кДНК между образцами. Звездочка указывает на значительную разницу в уровнях транскриптов TcCP30 между контрольными и тестовыми насекомыми (p = 1,6E-05, t-критерий). Данные представлены как среднее значение ± SE (n = 3).( B ) На левой панели показано отсутствие эффекта РНКи для TcCP30 на пигментацию кутикулы взрослого человека, включая пигментацию стенки тела взрослого человека, головы, нижних челюстей и ног (желтые стрелки), а также заднего крыла, включая птеростигму (черные стрелки), как видно через кутикулу куколки на стадии взрослой особи фарата (5-й день куколки). Однако около 70% взрослых особей не смогли сбросить свою старую кутикулу и умерли, не претерпев полного выпадения (средняя панель). У взрослых особей, которые закрывались, были расщепленные надкрылья (правая панель).

Рисунок 3

Специфичность анти-TcCP30-антитела и доказательства перекрестного связывания TcCP30.

( A ) Белки экстрагировали из переднеспинки и надкрылий, вырезанных из пяти ds TcCP30 — (ds CP30 ) и из ds TcVer (ds Puprate 5 pae обработанных взрослых особей) ). ( B ) Белки экстрагировали из надкрылий поздних стадий развития (от 4-дневных куколок до 2-дневных взрослых особей) насекомых дикого типа (n = 5). Эквивалентные количества экстрактов анализировали с помощью 15% SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси (левые панели в A и B) или вестерн-блоттингом (правые панели в A и B) соответственно.Стрелки указывают на белок TcCP30. P4, 4-й день куколки; P5, 5-й день куколки; A0, день 0 взрослых; A1, день 1, взрослые; A2, день 2 взрослых.

Рисунок 4

TcCP30 участвует в сшивании.

( A ) TcCP30 сшивается с TcCPR27 и TcCPR18. Белки, извлеченные из Elytra, рассеченные от пяти DS TCCPR27 (DS CPR27 ) -, DS TCCPR18 (DS CPR18 ) — DS TCCP30 (DS CP30 ) — или DS TCCPR4 (DS Насекомых, обработанных CPR4 ), (200 нг на насекомое) собирали на 0-й день взрослой стадии и анализировали с помощью 15% SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси (левая панель) или вестерн-блоттингом (правая панель).Стрелки на правой панели указывают на крупные иммунореактивные белки TcCP30 с кажущейся молекулярной массой ~ 37 и ~ 45 кДа. дцРНК для TcVer (ds Ver ) (200 нг на насекомое) вводили в качестве отрицательного контроля. ( B ) Lac2 участвует в сшивании TcCP30. дцРНК для TcCP30 (ds CP30 ) (200 нг на насекомое) или TcLac2 (ds Lac2 ) (20 нг на насекомое) инъецировали личинкам поздней стадии развития и куколкам возраста 0–1 d соответственно. Белки экстрагировали из переднеспинки и надкрылий, вырезанных из пяти обработанных дцРНК насекомых, собранных на стадии взрослой особи 0 дней (A0), и проанализировали с помощью 15% SDS-PAGE с последующим окрашиванием Кумасси (левая панель) или вестерн-блоттингом (правая панель). .Стрелки на левой панели указывают TcCP30-подобные белки (обратите внимание, что они отсутствуют на дорожках ds CP30 ). дцРНК для TcVer (ds Ver ) (20 или 200 нг на насекомое) вводили в качестве отрицательного контроля.

Рисунок 5

Локализация белка TcCP30 в кутикуле надкрылий во время развития.

Криосрезы (~12  мкм) куколок в возрасте 4 и 5 дней и взрослых особей в возрасте от 0 до 1 дня инкубировали с антителом против TcCP30. Антитело к TcCP30 было обнаружено с помощью конъюгированного с Alexa Fluor 546 антикроличьего IgG-антитела (красный).FITC-конъюгированный хитин-связывающий зонд (FITC-CBD) использовали для окрашивания кутикулярного хитина (зеленый). Ядра окрашивали TO-PRO3 (синий). На объединенных изображениях желтый: TcCP30 и хитин, фиолетовый: TcCP30 и ядра. P4, куколка 4-го дня; P5, куколка 5-го дня; A0, день 0 взрослый; А1, день 1 взрослый. Э, надкрылья; D — дорсальная кутикула надкрылий; V — вентральная кутикула надкрылий; DE — дорсальный слой эпителиальных клеток надкрылий; VE — вентральный слой эпителиальных клеток надкрылий; Н, заднее крыло; Т, трахея; P, кутикула куколки. Масштабная линейка = 20 мкм.

Рисунок 6

Локализация белка TcCP30 в дорсальной кутикуле надкрылий.

Ультратонкие срезы (~90 нм) взрослых фаратов (куколки 5-го дня), которым вводили ds TcCP30 или ds TcVer (200 нг на насекомое) на поздней личиночной стадии, инкубировали с антителом против TcCP30 . Затем антитело TcCP30 определяли с использованием козьего антикроличьего IgG, конъюгированного с частицами золота размером 10 нм. Белок TcCP30 присутствует как в горизонтальных хитиновых пластинках, так и в вертикальных PCF дорсальной кутикулы надкрылий контрольных насекомых, обработанных ds TcVer (левые панели).После РНКи для TcCP30 количество золотых частиц уменьшилось у насекомых с дефицитом TcCP30 (правые панели) по сравнению с контрольными насекомыми, получавшими ds TcVer . APMP, апикальные выпячивания плазматической мембраны; АН, конверт; ЭП, эпикутикула; PCF, волокна поровых каналов. Масштабная линейка = 500 нм.

Белок TcCP30 подвергается перекрестному сшиванию

Поликлональное антитело против CP30 было получено с использованием синтезированного пептида (E 160 -W 171 ) (рис. 1B) в качестве антигена, который соответствует С-концевой области белок TcCP30.Для повышения специфичности антител антисыворотку TcCP30 очищали с использованием аффинной колонки с иммобилизованным rTcCP30. Для проверки специфичности очищенного антитела TcCP30 был проведен Вестерн-блот анализ белковых экстрактов из необожженных надкрылий, вырезанных из обработанных ds TcVer контрольных и ds TcCP30 — обработанных куколок на 5-й день (взрослые фараты). Антитело TcCP30 обнаружило только один основной белок с ожидаемой кажущейся массой (~30 кДа) (рис. 3A и P5 на рис. 3B) и несколько дополнительных белков с более высокой молекулярной массой (>37 кДа) в ds TcVer , но не в экстрактах насекомых, обработанных ds TcCP30 (рис.3А). Тот факт, что белки TcCP30 значительно истощены после РНКи для этого гена, подтвердил специфичность антитела (сравните картину окрашивания Кумасси на дорожке ds TcVer с паттерном окрашивания ds TcCP30 ; на левой панели указано положение TcCP30). по стрелкам).

Чтобы оценить гипотезу перекрестного связывания TcCP30, мы экстрагировали белки как из переднеспинки, так и из надкрылий, вырезанных из куколок 5-го дня, обработанных ds TcVer и ds TcCP30 .Дубление кутикулы переднеспинки взрослых фаратов происходит перед вылуплением, тогда как дубление надкрылий происходит в первую очередь после вылупления. Некоторые БО переднеспинки уже сшиты во время линьки куколки и взрослой особи 21 . Как показано на правой панели рис. 3A, антитело TcCP30 обнаружило несколько иммунореактивных белков переднеспинки с молекулярной массой 30 кДа и выше в ds TcVer , но не в белковых экстрактах переднеспинки ds TcCP30 . Точно так же белок с молекулярной массой 30 кДа и несколько более крупных иммунореактивных белков были обнаружены в белковом экстракте из надкрылий, полученных от взрослых особей дикого типа в день 0 (правая панель на рис.3Б). Эти белки, однако, не обнаруживались в белковом экстракте взрослых особей на 1-й день (рис. 3В). Поскольку TcCP30 и несколько TcCP30-иммунореактивных белков с высокой молекулярной массой были обнаружены в необработанных и частично дублированных дорсальных кутикулах надкрылий и были гораздо менее экстрагируемы в дубленых взрослых кутикулах как из надкрылий, так и из переднеспинки (рис. 3 и 4B), мы предполагаем, что TcCP30 быстро становится активным. сшиты в жестких взрослых кутикулах.

TcCPR4 (белок RR-1) 34 и как TcCPR27, так и TcCPR18 (белки RR-2) 21,22 являются многочисленными БО, обнаруженными в жестких кутикулах надкрылий, переднеспинки и брюшной полости взрослых особей T.castaneum (рис. 3 и 4А). Чтобы оценить, являются ли эти БО партнерами по перекрестному сшиванию TcCP30, мы проанализировали белки, выделенные из надкрылий, вырезанных из ds TcCPR4-, ds TcCPR27 -, ds TcCPR18-, ds TcCP30 5-1ds — и 0. взрослых, получавших лечение в день 0 с помощью SDS-PAGE. В дополнение к белку TcCP30 с молекулярной массой 25 кДа в белковых экстрактах контрольных насекомых, обработанных ds TcVer , были обнаружены два иммунореактивных белка TcCP30 с кажущейся молекулярной массой примерно 37 и 45 кДа (стрелки на рис.4А). Примечательно, что иммунореактивный белок 37 кДа отсутствовал у насекомых с дефицитом TcCPR27, тогда как иммунореактивный белок 45 кДа отсутствовал у взрослых с дефицитом TcCPR18. Ожидаемые размеры конъюгатов TcCP30-TcCPR27 (~37 кДа) и TcCP30-TcCPR18 (~43 кДа) сопоставимы с молекулярными массами этих двух основных иммунореактивных белков. Эти результаты позволяют предположить, что иммунореактивные белки 37 и 45 кДа представляют собой конъюгаты TcCP30 с TcCPR27 и TcCPR18 соответственно. Кроме того, несколько белков с более высокой молекулярной массой (> 60 кДа), присутствующих в экстрактах ds TcVer и ds TcCPR18 , были значительно снижены в экстракте ds TcCPR27 и отсутствовали в экстракте ds TcCP30 (скобка на рис.4А). Не наблюдалось очевидных различий в профилях TcCP30-иммунореактивности между белками, выделенными из надкрылий, вырезанных из ds TcCPR4 — или ds TcVer-, обработанных взрослыми в день 0 (фиг. 4A). Этот результат предполагает, что TcCPR4 не является партнером по сшивке TcCP30. Все эти данные указывают на то, что TcCP30 становится конъюгированным как с TcCPR27, так и с TcCPR18 (и, возможно, с др.) белками in vivo .

Лакказа 2 участвует в сшивке белка TcCP30

При дублении кутикулы происходит сшивка в результате окислительных и нуклеофильных реакций между высокореакционноспособными хиноноидами, полученными из N -ацетилдопамина (НАДА) или N -β -аланилдопамин (NBAD) и нуклеофильные боковые цепи ХП 5,24,25 .Ранее мы сообщали, что окисление катехолов катализировалось фенолоксидазой, лакказой 2 (TcLac2) в T. castaneum 3 . РНКи TcLac2 не приводила к дублению кутикулы личинок, куколок или взрослых особей, и насекомые преждевременно погибали. Критическая роль Lac2 в дублении кутикулы, по-видимому, широко распространена среди видов насекомых 26,27,28,29,30,31,32 . Чтобы исследовать потенциальное перекрестное связывание TcCP30, мы получили рекомбинантный TcCP30 (rTcCP30) в E.палочка . Когда rTcCP30 инкубировали в присутствии лакказы 2 насекомых и NBAD, была получена лестница белков с более высокой молекулярной массой, размеры которых соответствовали SDS-стабильным сшитым мультимерам TcCP30 (дополнительные рисунки 3B и 3C). Реакция сшивания не происходила в отсутствие NBAD, что указывает на то, что продукт окисления NBAD лакказой 2 способствует сшиванию rTcCP30. Остатки гистидина, скорее всего, участвуют в хиноновых и/или хинон-метидных перекрестных связях катехолов с CP 24 .TcCP30 (21%), TcCPR27 (16%) и TcCPR18 (10%) имеют высокое содержание гистидина, в то время как TcCPR4 (3%) нет, что позволяет предположить, что перекрестное связывание TcCP30 с TcCPR27 и TcCPR18 может происходить через гистидины.

Чтобы оценить, требуется ли TcLac2 для перекрестного связывания белка TcCP30 в кутикуле надкрылий, мы вводили 20 нг ds TcLac2 в 0–1-й день куколки, чтобы вызвать гипоморфный фенотип у взрослых особей 3 . Антитело TcCP30 обнаружило белок с молекулярной массой 30 кДа и несколько более крупных иммунореактивных белков в белковом экстракте контрольных ds TcVer , обработанных взрослыми насекомыми в день 0 (скобки на рис.4B), тогда как интенсивность этих белков значительно снижалась в белковом экстракте насекомых того же возраста, обработанных ds TcLac2 . Этот результат указывает на то, что TcLac2 значительно усиливает образование белков с более высокой молекулярной массой, которые, вероятно, образуются путем перекрестного связывания TcCP30 с самим собой и/или другими кутикулярными белками, включая TcCPR27 и TcCPR18, окисленными катехолами. Сохранение небольшого количества перекрестно-сшитых белков, обнаруживаемых у насекомых, обработанных ds TcLac2 , может быть связано с неполной элиминацией белка TcLac2 в условиях РНКи, которые использовались для достижения гипоморфного фенотипа, а не летального фенотипа.

Локализация белка TcCP30

Для определения локализации белка TcCP30 во взрослой кутикуле T. castaneum было проведено иммуногистохимическое исследование эпидермальной ткани. Криосрезы (~ 12 мкм), приготовленные из взрослых особей фарата (4-й и 5-й день куколки) и молодых взрослых особей (0-й и 1-й день), инкубировали с антителом TcCP30 и белком FITC-CBD для мечения TcCP30 и хитина соответственно. У взрослых фаратов (куколки 5-го дня) белок TcCP30 был обнаружен в кутикулах дорсального надкрылья, вентральной части брюшка и грудной стенки тела, которые по мере созревания взрослых особей становятся сильно склеротизованными и пигментированными (рис.5 и дополнительный рис. 4), а также в эпителиальных клетках, лежащих в основе этих кутикул, таких как надкрылья (см. фиолетовый цвет на панелях «Слияние» на P5 и A0 на рис. 5 и дополнительный рис. 4B). Небольшое количество белка TcCP30 или его отсутствие было обнаружено в кутикулах, связанных с вентральным надкрыльем, задним крылом или спинным брюшком, все из которых мягкие, перепончатые и относительно непигментированные (рис. 5 и дополнительная рис. 4). Кутикула трахеи также была лишена TcCP30.

TcCP30 не обнаруживался в надкрыльях 4-дневных куколок, тогда как он легко выявлялся в дорсальной кутикуле надкрылий 5-дневных куколок, а также на более поздних стадиях развития (рис.5). Эти результаты согласуются с профилями экспрессии транскриптов гена TcCP30 (дополнительная рис. 2). Белок TcCP30 был совместно локализован с хитином в прокутикуле дорсальной кутикулы надкрылий (рис. 5 и дополнительная рис. 4B). Сигнал хитина в дорсальной кутикуле надкрылий оказывается слабее после эклозии взрослых особей (панели A0 и A1 на рис. 5), вероятно, из-за загара кутикулы, когда сшитые БО маскируют хитин, и/или из-за тушения пигментов. Флуоресценция FITC-CBD.

Чтобы понять функцию или важность конкретного CP в формировании кутикулы и влиянии на ее механические свойства, важно знать конкретное расположение белка в кутикуле. Техника ЭМ-иммунолокализации БО внутри кутикулы была введена более четверти века назад, и ранние данные были обобщены Willis et al (2005) 20 . Недавно Vannini et al. 33 проанализировали расположение кутикулярных белков AgamCPF3 и AgamCPLCG3/4 с помощью ПЭМ, меченого иммунозолотом во взрослой кутикуле Anopheles gambiae .Белок AgamCPF3 в основном локализован в экзокутикуле, тогда как два белка AgamCPLCG3/4 ограничены эндокутикулой. Расположение этих белков коррелирует с временной экспрессией их генов; максимальные уровни транскриптов первого были обнаружены у взрослых фаратов, тогда как транскрипты двух последних были максимальными у молодых взрослых особей после вылупления.

Ранее мы сообщали, что три функционально различных слоя, оболочка, эпикутикула и прокутикула 1,2 , были очевидны в жестких кутикулах, таких как дорсальные надкрылья, вентральная часть брюшка, грудная стенка тела и нога взрослого фарата (день 5 куколок) T.кастанеум 22 . Кроме того, в прокутикуле имеются не только многочисленные горизонтально ориентированные хитиновые пластинки, параллельные апикальной плазматической мембране эпидермальной клетки, но и многочисленные вертикальные столбчатые структуры, обозначаемые как поровые каналы (ПК), содержащие вертикально ориентированные хитиновые волокна. Они обозначаются как волокна поровых каналов (PCFs), которые выходят непосредственно из области чуть выше апикальных выступов плазматической мембраны (APMPs) нижележащих эпидермальных клеток (Figs. 6 and 7A).Поскольку в мягких, гибких и менее пигментированных кутикулах, таких как кутикулы дорсального брюшка, вентрального надкрылья и заднего крыла 22 , гораздо меньше горизонтальных пластинок и нет вертикальных ПКФ, эти наблюдения позволяют предположить, что плотное расположение многочисленных компактных пластинок и ПКФ способствует толщина и приобретение большей механической прочности жесткой кутикулы по сравнению с более тонкой и мягкой кутикулой.

Рисунок 7

Ультраструктура кутикулы надкрылий взрослых особей с дефицитом TcCP30.

( A ) Надкрылья взрослых особей фарата (куколки 5-го дня) и ( B ) взрослых особей 1-го дня, которым вводили ds TcCP30 или ds TcVer на поздней личиночной стадии, собирали для анализа ультраструктуры с помощью ТЕМ. На нижних панелях показаны увеличенные изображения горизонтальных пластинок и вертикальных поровых каналов в прокутикуле дорсальных кутикул надкрылий каждого из насекомых, обработанных дцРНК. АН, конверт; ЭП, эпикутикула; PRO, прокутикула; PCF, волокно порового канала; APMP, апикальное выпячивание плазматической мембраны.Масштабная линейка на верхних панелях = 2 мкм и на нижних панелях = 500 нм.

Чтобы определить более точную локализацию белка TcCP30 в дорсальной кутикуле надкрылий T. castaneum , мы выполнили мечение иммунозолотом с последующим анализом ПЭМ. Ранее мы сообщали, что белок TcCPR27 присутствует по всему прокутикуле как в горизонтальных хитиновых пластинках, так и в вертикальных PCF, в то время как TcCPR4 в основном присутствует в вертикальных PCF 22,34 . Как и TcCPR27, белок TcCP30 был локализован в горизонтальных пластинках и в вертикальных ПКФ, но не в слоях эпикутикулы или оболочки (рис.6). Обилие золотых частиц в прокутикуле дорсальной кутикулы надкрылий у насекомых с дефицитом TcCP30 было существенно снижено по сравнению с таковым у контрольных насекомых, обработанных ds TcVer (фиг. 6).

В отличие от обработанных ds TcCPR4 насекомых, у которых наблюдались аномальные и аморфные PCF 34 , не было очевидных различий в ультраструктуре дорсальной кутикулы надкрылий между контрольными ds TcVer — и ds TcCP520 — 900 взрослых особей куколки 5-го дня) или взрослые особи 1-го дня, включая оболочку, эпикутикулу, хитиновые горизонтальные пластинки и вертикальные поровые каналы, как показано с помощью ПЭМ-анализа (рис.7). Эти результаты свидетельствуют о том, что TcCP30 и его сшитые конъюгаты не участвуют в организации хитина в волокна горизонтальных пластинок и/или вертикальных поровых каналов. Необходимы дополнительные эксперименты для изучения роли перекрестного связывания TcCP30 на механическую прочность жесткой кутикулы взрослых особей T. castaneum .

Из четырех основных экстрагируемых кутикулярных белков в жестких кутикулах красного мучного жука, T. castaneum , два в настоящее время идентифицированы как белки RR-2, один как RR-1 и четвертый как белок низкой сложности без R & R мотив.Эксперименты с РНКи показали, что все четыре имеют функциональное значение в морфогенезе и/или ультраструктуре экзоскелета. Кроме того, TcCPR27 и TcCPR18, по-видимому, становятся перекрестно связанными с TcCP30 в основном благодаря действию лакказы 2, что, вероятно, способствует потере экстрагируемости этих белков. Многие другие CP присутствуют в жестких и гибких кутикулах жуков, и их значение в морфогенезе кутикулы требует дальнейших исследований.

Исследования кутикулы и мускулатуры пресноводного клеща Unionicola aegyptiaca | The Journal of Basic and Applied Zoology

Кутикула

Настоящие результаты показали, что кутикула пресноводного клеща Unionicola aegyptiaca состоит из двух основных слоев: эпикутикулы и прокутикулы.Также слой прокутикулы делится на два подслоя: экзокутикулу и эндокутикулу. Каждый из предыдущих подслоев разделен на две области (exo1 и exo2, а также en1 и en2 соответственно). Аналогичные результаты были зарегистрированы Sannasi и Oliver (1971) и SMRž (2005) на некоторых видах клещных видов, таких как DinothRombium Gigantum , Risysotritia Duplicata , STEGANACARUS STEGANUS , Steganacarus Magnus , Phthiracarus SP. И Tropacarus carinatus .Кроме того, Smrž (2005) сообщил об одинаковой структуре кутикулы на нимфальных стадиях некоторых видов клещей, таких как Hermannia gibba , Tectocepheus velatus , Scutovertex minutus , Achipteria coleoptrata и Achipteria coleoptrata и

В настоящих данных эпидермис выглядит как кубовидные клетки с густо окрашенными ядрами. Аналогичные данные были обнаружены у пресноводного клеща Unionicola fossulata (Mitchell, 1955). Саннаси и Оливер (1971) предположили, что эпидермальные клетки кутикулы клеща Dinothrombium giganteum образуют синцитий у нормального клеща.

Мускулатура

Настоящее исследование показало, что мускулатура пресноводного клеща Unionicola aegyptiaca делится на три области: гнатосомы (ротовые части), идиосомы и ноги. Сходные данные приводил Митчелл (1955, 1962) для других видов клещей унииколидных, Unionicola fossulata и Najadicola ingens , и клеща тромбикулидного, Blankaartia ascoscutellaris . Уитмойер и др. (1972) и Lindquist et al.(1996) разделили мускулатуру эриофиоидных клещей на три группы: скелетные, периферические и висцеральные мышцы. Они сказали, что скелетные мышцы включают гнатосомальные, дорсовентральные, генитальные и анальные области, а также ноги.

На каждой стороне тела области основания гнатосом и стержня хелицер данного вида, U. aegyptiaca , поддерживаются семью (4 поднимающими и 3 опускающими) и шестью (3 поднимающими и 3 опускающими) мышцами соответственно . Автор настоящей работы предположил, что сокращение хелицеральных мышц ответственно за подъем и опускание хелицерального когтя.Аналогичные данные были получены Mitchell (1955) для пресноводных клещей Unionicola fossulata и Najadicola ingens . Хелицеральный стержень Blankaartia ascoscutellaris состоит из трех поднимающих, двух депрессорных и двух протракторных мышц (Mitchell, 1962).

Сегменты пальцев настоящего вида U. aegyptiaca поддерживаются четырьмя мышцами-сгибателями, которые содержат от 3 до 8 тяжей. Пальпные сегменты Unionicola fossulata и Najadicola ingens поддерживаются тремя сгибателями, которые включают две мышцы и две полосы (Mitchell, 1955).Сегменты пальп Blankaartia ascoscutellaris состоят из трех поднимающих, двух депрессорных, трех сгибательных и трех приводящих мышц (Mitchell, 1962).

Кроме того, происхождение и прикрепление хелицеральных и пальпальных мышц U. aegyptiaca аналогичны таковым у Unionicola fossulata и Najadicola ingens (Mitchell, 1955). Четвериков (2014) показал, что челюстные мышцы (хелицеральные мышцы и внешние мышцы щупиков) и опистосомные мышцы клещей Loboquintus прикрепляются к трем задним впадинам у края продорсального щитка.

Настоящие данные показали, что идиосомная область данного вида включает дорсовентральные, поддерживающие, тазовые (поднимающие и опускающие) и генитальные мышцы. Подобные результаты были отмечены Mitchell (1955) для других видов пресноводных клещей, таких как Unionicola fossulata и Najadicola ingens . Митчелл (1962) сообщил, что различные области тела Blankaartia ascoscutellaris включают дорсальную, дорсовентральную, вентральную, тазовую (подъемники и депрессоры), генитальное поле и мышцы экскреторных пор.Treat (1965) изучил генитальные мышцы самок мотылькового клеща Dicrocheles phalaenodectes и разделил их на пять анатомических групп: дорзовентральную, латеральную, вентральную, эпигиниальную и эндостилярную.

Настоящая работа показала, что правая сторона идиосомной области пресноводного клеща, U. aegyptiaca , имеет шесть и пять дорсовентральных и поддерживающих мышц соответственно.

Mitchell (1955) изучал мускулатуру пресноводного клеща Unionicola fossulata и описал семь дорзовентральных и четыре поддерживающих мышцы.Mitchell (1962) сообщил о семнадцати дорсовентральных, шести дорсальных и восьми вентральных мышцах тромбикулярного клеща Blankaartia ascoscutellaris .

Существуют некоторые сходства и различия в количестве, происхождении и прикреплении дорсовентральных и поддерживающих мышц между настоящим видом U. aegyptiaca и пресноводным клещом Unionicola fossulata (Mitchell, 1955). В отличие от других клещей опистосомы эриофиоидных клещей практически лишены дорсо-вентрсальной мускулатуры (Nuzzaci, 1976; Шевченко, 1983, 1986).Шевченко (1983, 1986) наблюдал у Cecidophyopsis ribis большее количество вентролатеральных мышц в первом ювенильном возрасте.

В настоящей работе мышцы тазика U. aegyptiaca произошли от эпимер тазика и прикрепились к первому сегменту ног. Эти мышцы дифференцируются на четыре поднимающих и четыре опускающих во всех эпимерах тазика. Эти результаты согласуются с коксальными мышцами пресноводных клещей Unionicola fossulata и Najadicola ingens (Mitchell, 1955) и тромбикуловых клещей Blankaartia ascoscutellaris (Mitchell, 1962).Вероятно, следует отметить, что количество полос мышц, поднимающих и опускающих на эпимере тазика, у данного вида отличается от ранее опубликованных видов клещей (Mitchell, 1955, 1962).

Поле гениталий данного вида, U. aegyptiaca , поддерживается тремя парами мышц генитальной пластинки: дорзовентральной, вентральной и клапанной мышцами. Напротив, Митчелл (1955) проиллюстрировал две пары мышц генитальной пластинки пресноводного клеща U.фоссулата . Также генитальное поле B. ascoscutellaris связано с шестью парами мышц генитальной пластинки (Mitchell, 1962). Кроме того, экскреторная пора B. ascoscutellaris имеет пять пар экскреторных мышц.

Сегменты ног (l1–l4) пресноводного клеща Unionicola aegyptiaca поддерживаются протрактором (pr2), ретрактором (re2), пятью мышцами-сгибателями (fl3–fl7) и мышцами, поднимающими (el). Аналогичные данные сообщает Митчелл (1955, 1962) для клещей U.fossulata и B. ascoscutellaris. Количество тяжей мышц ног у U. aegyptiaca колебалось от 2 до 5 на всех ногах, в то время как у U. fossulata колебалось от 2 до 4 (Mitchell, 1955) и от 1 до 3 у B. .ascoscutellaris (Митчелл, 1962). Происхождение и прикрепление мышц ног U. aegyptiaca сходны с мышцами U. fossulata и B. ascoscutellaris (Mitchell, 1955, 1962 соответственно).Вероятно, следует отметить, что депрессорные мышцы предплюсны ноги отсутствовали у U. aegyptiaca и U. fossulata (Mitchell, 1955) и присутствовали у B. ascoscutellaris (Mitchell, 1962).

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Posted in Разное

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.