Цветные кляксы: D1 86 d0 b2 d0 b5 d1 82 d0 bd d1 8b d0 b5 d0 ba d0 bb d1 8f d0 ba d1 81 d1 8b — векторные изображения, D1 86 d0 b2 d0 b5 d1 82 d0 bd d1 8b d0 b5 d0 ba d0 bb d1 8f d0 ba d1 81 d1 8b картинки

Цветные кляксы: D1 86 d0 b2 d0 b5 d1 82 d0 bd d1 8b d0 b5 d0 ba d0 bb d1 8f d0 ba d1 81 d1 8b — векторные изображения, D1 86 d0 b2 d0 b5 d1 82 d0 bd d1 8b d0 b5 d0 ba d0 bb d1 8f d0 ba d1 81 d1 8b картинки

17.12.2019

Содержание

%d0%ba%d0%bb%d1%8f%d0%ba%d1%81%d0%b0 PNG образ | Векторы и PSD-файлы

  • дизайн плаката премьера фильма кино с белым вектором экрана ба

    1200*1200

  • Ручная роспись борода ба zihu большая борода

    1200*1200

  • сердце сердцебиение любовь свадьба в квартире цвет значок векторная icon

    5556*5556

  • мода с днем ​​рождения шрифты

    1200*1200

  • Закир навид ашик ба урду каллиграфия бесплатные eps и png

    5000*5000

  • рисованный мультфильм счастливый конец блюдо на банджо шеф

    2000*2000

  • естественный цвет bb крем цвета

    1200*1200

  • пример с австралией праздник плакат или баннер

    1200*1200

  • ма дурга лицо индуистский праздник карта

    5000*5000

  • красивый современный всплеск кофе с кофе в зернах

    3333*3333

  • набор векторных иконок реалистичные погоды изолированных на прозрачной ба

    800*800

  • мультфильм здание с зеленой крышей вектор illustartion на белом ба

    1200*1200

  • вектор поп арт иллюстрацией черная женщина шопинг

    800*800

  • Векторная иллюстрация мультфильм различных овощей на деревянном ба

    800*800

  • ба конфеты шоколад

    800*800

  • чат комментарий образование синий значок на абстрактных облако сообщение

    5556*5556

  • ценю хорошо как плоская цвет значок векторная icon замечания

    5556*5556

  • вектор поп арт иллюстрацией черная женщина шопинг

    800*800

  • 3d модель надувной подушки bb cream

    2500*2500

  • Красивая розовая и безупречная воздушная подушка bb крем косметика постер розовый красивый розовый Нет времени На воздушной

    3240*4320

  • коробка и объектив камеры значок дизайн вдохновение изолирован на белом ба

    1200*1200

  • малыш парень им значок на прозрачных ба новорожденного весы вес

    5556*5556

  • Крутая музыка вечеринка певца креативный постер музыка Я Май Ба концерт вечер К

    3240*4320

  • Косметический bb Крем Дизайн Плаката косметический Косметика постер Реклама косметики Плакат

    3240*4320

  • аэрозольный баллончик увлажняющий лосьон bb cream парфюм для рук

    3072*4107

  • чат пузыри комментарии разговоры переговоры аннотация круг ба

    5556*5556

  • bb крем ню макияж косметика косметика

    1200*1500

  • аркада консоли игры машина играть в соответствие значок на прозрачных ба

    5556*5556

  • цвет перо на воздушной подушке bb крем трехмерный элемент

    1200*1200

  • кодер кодирование компьютер список документ линии значок на прозрачных ба

    5556*5556

  • happy singing mai ba sing self indulgence happy singing

    2000*2000

  • концепция образования в выпускном вечере баннер с цоколем и золотой ба

    6250*6250

  • новые facebook покрытия с red lion и черный и синий полигональной ба

    5556*5556

  • простая инициализация bb b геометрическая линия сети и логотип цифровых данных

    2276*2276

  • пример с австралией праздник плакат или баннер

    1200*1200

  • пример с австралией праздник плакат или баннер

    1200*1200

  • Шань Хай Цзин Ба змея Отличный зверь монстр

    2000*2000

  • розовый бб крем красивый бб крем ручная роспись бб крем мультфильм бб крем

    2000*3000

  • две бутылки косметики жидкая основа белая бутылка крем bb

    2000*2000

  • цифровой маркетинг ремаркетинга квартиру цвет значок векторная icon

    5556*5556

  • крем крем вв вв на воздушной подушке иллюстрация

    2000*2000

  • пузыри чат замечания разговоры переговоры резюме круга ба

    5556*5556

  • Счастливого Дивали традиционного индийского фестиваля карта с акварелью ба

    5041*5041

  • церковь

    5556*5556

  • 99 имен аллаха вектор al baith асма husna

    2500*2500

  • bb кремовый плакат белый макияж косметический На воздушной подушке

    3240*4320

  • геймпад playstation квартиру цвет значок векторная icon видеоигра

    5556*5556

  • деньги долг финансы помочь кредит им значок на прозрачных ба

    5556*5556

  • в поход местонахождение им значок на прозрачных ба карта план трек

    5556*5556

  • bb крем cc крем пудра Порошок торт фонд

    2000*2000

  • Цветные кляксы на белом фоне

    Корзина Купить!

    Изображение помещёно в вашу корзину покупателя.

    Вы можете перейти в корзину для оплаты или продолжить выбор покупок.
    Перейти в корзину…

    удалить из корзины

    Размеры в сантиметрах указаны для справки, и соответствуют печати с разрешением 300 dpi. Купленные файлы предоставляются в формате JPEG.

    ¹ Стандартная лицензия разрешает однократную публикацию изображения в интернете или в печати (тиражом до 250 тыс. экз.) в качестве иллюстрации к информационному материалу или обложки печатного издания, а также в рамках одной рекламной или промо-кампании в интернете;

    ² Расширенная лицензия разрешает прочие виды использования, в том числе в рекламе, упаковке, дизайне сайтов и так далее;

    Подробнее об условиях лицензий

    ³ Лицензия Печать в частных целях разрешает использование изображения в дизайне частных интерьеров и для печати для личного использования тиражом не более пяти экземпляров.

    Пакеты изображений дают значительную экономию при покупке большого числа работ (подробнее)

    Размер оригинала: 3500×5000 пикс. (17.5 Мп)

    Указанная в таблице цена складывается из стоимости лицензии на использование изображения (75% полной стоимости) и стоимости услуг фотобанка (25% полной стоимости). Это разделение проявляется только в выставляемых счетах и в конечных документах (договорах, актах, реестрах), в остальном интерфейсе фотобанка всегда присутствуют полные суммы к оплате.

    Внимание! Использование произведений из фотобанка возможно только после их покупки. Любое иное использование (в том числе в некоммерческих целях и со ссылкой на фотобанк) запрещено и преследуется по закону.

    Конспект открытого занятия студии «Палитра». Тема: «Цветные кляксы»

    Тема занятия:  Линейная перспектива

    Цели и задачи:

    формирование у учащихся знаний и навыков практической деятельности в изображении пейзажа с использованием правил линейной   перспективы.

    развитие воображения, образного мышления, пространственного представления, способности к художественному творчеству.

    воспитание чувства красоты к окружающей природе и бережного отношения к ней.

     Материалы и оборудование: репродукции картин с пейзажами ( И.Шишкина, И.Левитана, Ф. Щедрина В. Поленова, К. Крыжицкого и.др.),   формат А 4, карандаш,  доска для наглядного показа.

    I. Организационный момент.

    Если видишь на картине,

     Нарисована река,

     Живописные долины,

     И дремучие леса,

     Белокурые березки,

     Или старый крепкий дуб,

     Или вьюга, или ливень,

     Или солнечный денек.

     Нарисованным быть может,

     Или север, или юг.

     И любое время года

     Мы в картине разглядим.

     Не задумываясь, скажем:

     Называется пейзажем!

     Учитель: А что такое пейзаж?

    Ответы детей: Это жанр изобразительного искусства.

    ПЕЙЗАЖ (произошло от франц. paysage — страна, местность) – жанр изобразительного искусства а, в котором основным предметом изображения является природа.

    Учитель: Название жанра распространяется на изображение естественной или преобразованной человеком природы, окружающей среды, характерных ландшафтов, видов гор, рек, лесов, полей, городов, исторических памятников, всего богатства и разнообразия растительности.

    Какие пейзажи бывают?

    Ответы детей: В зависимости от характера пейзажного мотива, можно выделить сельский, городской, индустриальный пейзаж, морской.

    Учитель:  Пейзаж может носить исторический, героический, фантастический, лирический и эпический характер. А в каких видах изобразительного искусства существует пейзаж?

    Ответы детей:  Пейзаж может быть в графике и живописи.

    Учитель: назовите основные элементы пейзажа.

    Дети:  В пейзаж входят некоторые основные элементы:

    земная поверхность

    растительность

    постройки

    Учитель: Картина пейзаж также может включать:

    водоёмы (озера, моря, реки)

    фауну

    людей

    свет

    облака, дождь.

     II.Изучение новой темы.

    Учитель:  Сегодня мы совершим путешествие в природу, отраженную художником на холсте. В 19 веке многие русские пейзажисты обращались к жанру пейзаж. Среди этих пейзажистов можно выделить несколько художников такие, как И. Шишкин, И. Айвазовский, А. Саврасов, Ф. Васильев много, много других. Именно в 19 веке было написано много пейзажных шедевров. Для создания полноценной картины, художнику было необходимо написать множество пейзажных этюдов, рисунков простым карандашом изучая натуру. И. Шишкин много рисовал карандашом свои лесные пейзажи, и в этом ему нет равных. А. Саврасов одним из первых показал в пейзаже грязные русские размытые дождем проселочные дороги, отразил романтизм мокрых полей, даже серый весенний день в его пейзаже смотрится прекрасным. Ф. Васильев проживший очень короткую жизнь, но создавший немало красивых пейзажей, заставивший сопереживать зрителя с увидевшим им красотами родной природы. Создавая реалистические пейзажи, современные художники вдохновляют нас любить и беречь родную природу.

    Написание картины в русской пейзажной живописи, всегда выделялось на фоне изобразительного искусства, изображая природу человека к природе, художник выражает подлинную любовь к красоте окружающего нас мира.

    Учитель: Тема нашего урока: «Правила линейной и воздушной перспективы». Ознакомившись с темой нашего урока, вы научитесь писать замечательные пейзажи, передавать красоту русской природы, передавать глубину и пространство. Постараетесь выразить свое настроение, цвет неба и земли, дыхание леса, движение облаков, прозрачность и свет, постараетесь передать ту загадку природы, которая вдохновляет художников во все времена. Для изображения пространства в пейзаже необходимо знать правила линейной и воздушной перспективы

    А что такое перспектива?

    ПЕРСПЕКТИВА — (фр. perspective, от лат. perspicio — ясно вижу) — системы изображения на плоскости пространства и объемных тел, их пространственной структуры, расположения в пространстве и удаления от наблюдателя. ПЕРСПЕКТИВА в изобразительном искусстве служит как воссозданию образа видимого мира, так и истолкованию мира, выражению той или иной концепции мироздания. Попытки передать воздушную перспективу наблюдаются уже в средневековых пейзажах Китая, Кореи, Японии. Но свое теоретическое обоснование метод получил в XVI веке в работах Леонардо да Винчи. Леонардо да Винчи обосновал принципы воздушной перспективы влияние воздушной среды на уменьшение четкости очертаний предметов и на изменение их цвета с удалением от наблюдателя.

    (Вместе с детьми подойти к определению таких понятий как: линейная перспектива, воздушная перспектива, видимый горизонт, линия горизонта, линии схода, точка схода.)

    Линейная перспектива — это закономерное изменение масштабов изображения разноплановых объектов расположенных на плоскости. Иными словами, это технический рисунок. Линейная перспектива способствует достижению пространственного воздействия посредством изменения формы групп растений и архитектурных элементов. Она помогает укоротить или удлинить расстояния между ними.

     Видимый горизонт — это линия, на которой сходятся земля и неба.

    Линия горизонта  (упрощенный истинный горизонт) — это воображаемая прямая, условно находящаяся в пространстве на уровне глаз наблюдателя.

    Линии схода — это линии, образующие края формы объекта с учетом их удаленности от точки наблюдения и показывают положение объекта в перспективе.

    Точка схода — точка, в которой соединяются линии схода.

    При рисовании пейзажа первой задачей представляется выделить в натуре границы пространства, подлежащего изображению, и связать его с листом бумаги. Иногда помощь в установлении границ рисунка может оказать «видоискатель» — картонное окошко с подвижной заслонкой, дающее возможность варьировать отношения сторон прямоугольника окна, обычно между одним и двумя квадратами. Стоя на улице обсаженной деревьями можно наблюдать, как по мере удаления деревья становятся всё меньше и меньше, и самое большое дерево вдали будет не больше карандаша в руке. То же происходит и с машинами, в конце длинной улицы они кажутся игрушечными. Люди, по мере удаления, кажутся всё меньше и меньше.

    Так ведут себя, подчиняясь законам перспективы вертикальные предметы. А что происходит с горизонтальными линиями? Линии разметок на проезжей части, линии тротуаров по обе стороны улицы, линии горизонтальных архитектурных элементов зданий, удаляясь от нас, начинают постепенно сближаться и в самой дали, сходятся в одной точке, которую мы в пятом уроке назвали точкой схода. Через эту точку проходит линия горизонта. Каждый дом на улице, повёрнутый к зрителю боком, имеет две точки схода на линии горизонта, которые в рисунке могут быть расположены далеко за пределами листа бумаги, У художника глаз тренированный и он может убедительно определить перспективные сокращения размеров зданий и предметов на улице, без каких либо вспомогательных приёмов построения перспективы. Начинающему художнику, что бы развить чувство перспективы надо постоянно сравнивать и сопоставлять размеры и формы предметов относительно друг друга. Если изобразить в пейзаже фигуру человека, животных или их несколько, то очень важно правильно учесть перспективное сокращение несколько пренебрегать законами линейной перспективы.

    Приступая к выполнению самостоятельной работы, первое выберите тему для пейзажа .

    Прежде всего, определите в пейзаже плоскость земли и неба.

    Затем уточните положение линии горизонта. Относительно ее определи место основных элементов композиции. Никаких мелких деталей не должно быть на данном этапе. Думайте о выразительности композиции. Не перегружайте формами какую-либо часть изображения. Это может привести к нарушению композиционного равновесия.

    Помните об основных положениях  линейной перспективы:

    чем дальше предмет, тем меньше он кажется;

    все горизонтальные параллельные линии, уходящие от вас вдаль, сходятся в точке схода, принадлежащей линии горизонта;

    линии, которые расположены выше уровня горизонта, будут опускаться вниз к горизонту ,и стремиться к точке схода;

    линии, расположенные ниже уровня горизонта будут подниматься вверх к линии горизонта и стремиться к точке схода;

    мерою движения в глубину пейзажного пространства будут предметы на горизонтальной поверхности: деревья, кусты, строения, люди, животные,

    если объект находится очень близко, то его передняя часть будет казаться больше, чем дальняя.

    III. Практическая работа. Дети карандашом делают линейные построения пейзажей. Учитель ведет наблюдение, оказывает индивидуальную помощь.

    IV. Анализ работ.

    Каждый из вас видит природу по – своему, каждый изобразил излюбленный мотив. Работы получились разнообразными, каждый выразил в пейзаже своё видение природы. Старались передать линейную  перспективу.   Рисунки заслуживают положительной оценки, но есть и недостатки в работах. Давайте их найдём и проанализируем.

    VII. Выставка лучших  набросков пейзажей.

     

     

     

    Цветные стержни для клеевого пистолета. Schreiber. Артикул S-8718 — «Цветные кляксы на Ваших поделках ))) Стержни для клеевого пистолета настроят на творческий лад !!!»

    Здравствуйте, милые женщины !!!

    Сегодня я расскажу об одном своём хобби, не знаю как точно его назвать — но если в общем, это приклеивание, оформление, украшение чего-либо маленькими деталями.

    Розочками, цветочками, пуговичками.

     

    Могу обклеивать коробочки, баночки, одежду. Делать открытки, аппликации.

     

    В этом очень помогает клеевой пистолет и стержни для клеевого пистолета.

    До сих пор они у меня были прозрачными, как обычный силиконовый клей.

     

    Но недавно я купила совсем другие — ЦВЕТНЫЕ !!!

    Упаковка — прозрачный пакетик, в котором находятся — два белых стержня, два чёрных, два жёлтых, два красных и два зелёных.

    Всего 10 штук.

    Пистолетик у меня маленький, поэтому стержни я покупала самого маленького диаметра — 0,7 мм.

    Держится стержень хорошо.

    Быстро плавится.

    Красивые цветные лужицы — красная, зелёная, жёлтая — очень красивые и радуют взгляд )))

    Стержни имеют характерный запах клея, но мне он очень нравится — слегка резиновый, тонкий.

    Гибкие, пластичные, отнюдь не липкие.

     

    Я так понимаю, такие стержни предназначены для склеивания элементов таких же цветов, что и клей.

    Не так будет заметны следы клея.

     

    В общем, прекрасная идея!

    Спасибо производителям !

     

    Всего Вам самого доброго .

    Спасибо, что заглянули !

    Мышь одна Капля Maus van Klecks

    Возраст 5-99
    кол-во игроков 3-5

    Маленькая Мышка фон Капелька – известная на весь мир художница. Сегодня она пригласила своих лучших друзей к себе в галерею, чтобы

    нарисовать что-нибудь вместе. Воодушевленные, они хватают кисточки, краски, холсты и приступают к делу! Но что это? Палитра художницы

    слишком мала: на ней есть место лишь для трех цветов! Как же нарисовать машинку? А домик? И даже бабочку? В каждом раунде игрок выбирает по три цвета (чтобы никто не увидел!) и капает их на палитру. Затем вы сравниваете между собой: за совпадения в качестве вознаграждения художники-зверята получают вкусные пирожные. Тот, кто первым получит 3 пирожных, побеждает в игре!

    Содержание игры:

    1 мышка фон Капелька, 1 собака Пабло, 1 тигр Винсент, 1 курица Ники, 1 заяц Фрида, 5 палитр, 5 защит от подглядывания, 4 кисточки, 3 карандаша, 15 пирожных, 50 цветных клякс (в 10 различных цветах), 1 кубик, 5 пакетиков для хранения игрового материала, 1 инструкция к игре

    Подготовка к игре:

    Каждый игрок берет фигурку, подходящую ей защиту от подглядывания, палитру, 10 цветных клякс (по одной в каждом цвете). Поставьте перед собой защиту от подглядывания, за которой спрячьте палитру и цветные кляксы таким образом, чтобы их никто не видел. В любом порядке разложите кисточки и карандаши на некотором расстоянии друг от друга в центре стола так, чтобы получился круг. Область между ними – поля для хода фигурками. Найдите также местечко для пирожных и положите туда все пирожные. Ваши фигурки ходят по одинаковому полю. Лишний игровой материал нужно убрать в коробочку. Держите наготове кубик.

    Ход игры:

    Вы играете по очереди по часовой стрелке много раундов. Игрок, который недавно нарисовал картинку, ходит первым и бросает кубик.

    Что изображено на кубике?

    На кубике изображено 6 разных символов, каждый из которых обозначает определенную категорию. В зависимости от того, какой символ тебе выпал на кубике, ты должен придумать объект из соответствующей категории, а именно:

    Животное

    Предмет

    Что-нибудь съедобное

    Что-нибудь, что появляется в сказке или в фильме

    Что-нибудь, о чем человек может мечтать или что он может желать

    Что-нибудь, что начинается с буквы, которую тебе подскажет твой левый сосед

    Подсказка:

    Для этого символа игроки помладше выбирают то, что есть в школе или в детском саду.

    Раздели четко игроков в соответствии с тем, какой объект для рисования они выбрали. Теперь игроки должны решить, при помощи каких трех цветов они раскрасят свой объект для рисования на холсте. За защитой от подглядывания три соответствующие цветные кляксы и положите их на холст. Только тогда, когда все игроки это проделают, они приподнимают свои защиты от подглядывания.

    Оценивание:

    Теперь по часовой стрелке от игрока, начинавшего игру, вы сравниваете цветные кляксы на ваших палитрах.

    Есть ли хотя бы у одного игрока одно или несколько цветных клякс на его палитре?

    Да. Отлично!

    За каждую цветную кляксу, которая есть по крайней мере на одной из остальных палитр, ты можешь продвинуть свою фигурку на поле вперед.

    В течение одного хода тебе разрешено продвигаться до трех полей вперед.

    Внимание: если твоя фигурка попала на поле с пирожным или продвинулась дальше, то ты получаешь пирожное в качестве вознаграждения. Положи его перед твоей защитой от подглядывания так, чтобы все видели.

    Нет.

    Жаль. Твоя фигурка остается на месте. 

    Пример:

    Тило на кубике выпал символ из категории «что-нибудь съедобное», и он подумал нарисовать клубнику. Следующие три кляксы выбрали игроки Тило, Ханна и Лео:

    Из этого получается следующий подсчет:

    Тило передвигает свою фигурку (за красную кляксу) на поле вперед, Ханна передвигает свою фигурку на два поля вперед (за красную и коричневую кляксу), и Лео – также за красную и коричневую.

    Новый раунд:

    После этого каждый игрок убирает цветные кляксы с палитры и снова ставит перед собой защиту от подглядывания. На очереди следующий игрок, который бросает кубик и начинает новый раунд.

    Конец игры:

    Игра заканчивается, как только один из игроков получает свое третье пирожное, тем самым выигрывая игру. Если в том же раунде свое третье

    пирожное получает несколько игроков, то и победителей будет несколько!

    Совместная игра для двух игроков:

    Мышь фон Капелька приглашает вас на дуэль! Удастся ли вам вдвоем заполучить третье пирожное до того, как это сделает мышка?

    Правила основной игры действуют до следующих изменений:

    До начала игры положите только три пирожных на поле старта вместо всех пирожных. Поставьте туда же мышь фон Капельку и фигурку,

    которую выбрали вместе.

    Каждый из вас выбирает любую защиту от подглядывания, чтобы спрятать свои собственные палитру и цветные кляксы.

    Тот, кто бросает кубик, называет понятие из соответствующей категории. Не договариваюсь между собой, каждый из вас ищет три подходящих цветных кляксы и прикрепляет их на свою палитру.

    Подсчет: за каждую неодинаковую цветную кляксу Мышь фон Капелька продвигается на поле вперед, а за каждую одинаковую цветную кляксу ваша фигурка продвигается на поле вперед. Важно, чтобы мышка всегда была впереди!

    Пример:

    Фигурка игроков продвигается на поле вперед, а мышка – на два.

    Если ваша фигурка попала на поле с пирожным или продвинулась дальше, то она получает пирожное в качестве вознаграждения.

    Игра заканчивается, как только Мышь фон Капелька или ваша фигурка получают второе пирожное, выигрывая тем самым игру

    Наклейка на стену с разноцветными пятнами — WallMonkeys.com

    Винил
    • Полуглянцевый
    • Съемный
    • Белый непрозрачный материал (непрозрачный)
    • Самоклеящаяся основа

    Vinyl приклеится практически к любой гладкой внутренней поверхности, включая стены, стекло, пол, окна и многое другое!

    Примечание. Если вы давний поклонник WallMonkeys, возможно, вам нужен наш предыдущий клей Photo-Tex. Винил — наш новый материал по умолчанию, мы считаем, что он лучше подходит для ваших стен.Вы можете запросить Photo-Tex для настенных росписей прямоугольной и квадратной формы в разделе примечаний при оформлении заказа.

    Все заказы печатаются и отправляются в течение 1-3 рабочих дней. Доказательства доступны в течение 1 рабочего дня с момента размещения заказа.

    Если для вашего заказа требуется подтверждение, производство может быть отложено на время внесения корректировок.

    * Срочное производство доступно по запросу. Ознакомьтесь с часто задаваемыми вопросами о срочном производстве здесь.


    См. Подробные инструкции здесь.

    1. Оставьте наклейку развернутой и разложенной (на ночь для размеров 36 дюймов и больше).
    2. Очистите поверхность сухой тканью от пыли и химикатов.
    3. Осторожно удалите наклейку с бумажной подложки. Для размеров 36 дюймов и выше рекомендуются дополнительные руки.
    4. Плотно пригладьте поверхность наклейки к стене, начав с центра и толкая наружу. Удалите и повторно приложите углы, чтобы выпустить пузырьки воздуха.



    Можно ли использовать наклейки WallMonkeys на улице?
    — Нет, винил предназначен только для использования внутри помещений.
    Будет ли удален белый фон?
    — Да, любой полностью белый фон будет отслаиваться, когда наклейка помещается на стену. Для более сложных дизайнов может потребоваться небольшая белая рамка для облегчения нанесения.
    Могу ли я настроить наклейку?
    — Да, все заказы печатаются по запросу. Мы бесплатно предлагаем нестандартные размеры и настройку зеркального отображения. Просто добавьте примечание к своему заказу при оформлении заказа.
    Могу ли я предварительно просмотреть свой заказ перед его печатью?
    — Да, цифровое подтверждение предоставляется по запросу в течение 1 рабочего дня. Запросите его в разделе заметок при оформлении заказа.

    Дополнительные ответы на часто задаваемые вопросы см. Здесь.


    Субстраты для хромогенного вестерн-блоттинга | Thermo Fisher Scientific

    Хромогенные или осаждающие субстраты широко используются в течение многих лет и предлагают самый простой и наиболее экономичный метод вестерн-блоттинга.Когда эти субстраты вступают в контакт с соответствующим ферментом, они превращаются в нерастворимые окрашенные продукты, которые осаждаются на мембране. Полученная цветная полоса или пятно не требует специального оборудования для обработки или визуализации. Субстраты для хромогенного блоттинга доступны в различных спецификациях и форматах. Подходящий выбор субстрата зависит от метки фермента, желаемой чувствительности и формы сигнала или необходимого метода обнаружения.


    Вступление

    В отличие от хемилюминесцентного или флуоресцентного блоттинга, обнаружение с помощью хромогенных субстратов не требует специального оборудования для визуализации результатов анализа. Подобно проявочной пленке, блот инкубируется в субстрате до тех пор, пока не будет достигнута желаемая степень проявления. В отличие от хемилюминесцентного вестерн-блоттинга окрашенный осадок, образованный хромогенными субстратами, не может быть легко удален для облегчения процедур повторного зондирования. Поэтому важно позволить реакции продолжаться до тех пор, пока цвет не станет удовлетворительным, а затем остановить реакцию.

    Низкая чувствительность хромогенных субстратов затрудняет оптимизацию для обнаружения белков с низким содержанием.Хотя реакции можно дать развиваться в течение нескольких часов или даже в течение ночи, это также позволяет продолжить развитие фонового сигнала. Там, где хромогенные субстраты не чувствительны, они идеальны для применений, где высока концентрация белка. Поскольку продукт реакции субстрата представляет собой окрашенный осадок, сигнал стабильный; поэтому хромогенные субстраты обычно не имеют проблем с ложноотрицательными результатами (фантомные полосы), которые могут возникнуть с хемилюминесцентными субстратами. Характеристики конкретного субстрата могут резко отличаться при приобретении у разных поставщиков. Это связано с тем, что на характеристики могут влиять концентрация и чистота субстрата, а также другие добавки и компоненты буфера, которые входят в состав препарата.

    Техническое руководство по обнаружению белков

    В этом 84-страничном справочнике подробно описывается последний шаг в рабочем процессе вестерн-блоттинга — обнаружение белков. Имея на выбор множество методов обнаружения (хемилюминесцентный, флуоресцентный или хромогенный), вы можете выбрать технологию, соответствующую вашим экспериментальным требованиям и имеющимся у вас инструментам. Будь то быстрая визуализация или точный количественный анализ, детектирование с помощью одного зонда или мультиплексирование — Thermo Fisher Scientific предлагает широкий выбор реагентов и наборов для вестерн-блоттинга и последующего анализа.

    Запрос загрузки


    Хромогенные субстраты для вестерн-блоттинга пероксидазы хрена

    Перекись должна быть добавлена ​​к субстрату для колориметрического определения пероксидазой хрена (HRP). Из-за чрезвычайно короткого срока хранения при желаемой концентрации пероксид водорода традиционно добавляли в буфер вместе с субстратом непосредственно перед использованием. В результате эти подложки обычно имеют полезный срок хранения всего несколько часов. Многие коммерчески доступные преципитирующие субстраты HRP поставляются со стабильным буфером субстрата пероксидазы или готовятся в нем. Стабилизированная перекись в этих растворах обычно концентрированная и менее коррозионная, чем традиционный 30% основной раствор перекиси водорода.Поскольку 30% перекись водорода и разбавленные растворы перекиси водорода нестабильны, реагенты, приготовленные со стабилизированной перекисью, дадут более стабильные результаты.

    Хромогенные субстраты для вестерн-блоттинга с HRP.


    3,3 ‘, 5,5’-тетраметилбензидин (TMB) с молекулярной массой 240,4 чаще всего используется в качестве субстрата для HRP в ELISA. Однако в присутствии HRP и пероксида образуется водорастворимый синий продукт, который может осаждаться на мембране. Раствор субстрата для одностадийного ТМВ-блоттинга Thermo Scientific представляет собой однокомпонентный субстрат пероксидазы для вестерн-блоттинга и иммуногистохимии.Осаждение продукта приводит к появлению темно-синих полос, на которых расположен фермент. Одношаговый раствор для субстрата для TMB-блоттинга хорошо подходит для приложений, требующих большого отношения сигнал / шум. Ниже описаны наиболее распространенные субстраты для колориметрического HRP.

    Хромогенный вестерн-блоттинг с использованием одностадийного раствора Ultra TMB-Blotting Solution. Серийные разведения лизата клеток HeLa (7,5, 3,45, 1,88, 0,94, 0,47, 0,23 и 0,12 мкг) были приготовлены и разделены электрофорезом. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны, и мембрану блокировали 5% обезжиренным молоком в TBS + 0,05% Thermo Scientific Tween 20. После блокирования мембрану инкубировали с поликлональными антителами к белку теплового шока 86 в концентрации 0,5 мкг / мл. Мембрану промывали и затем инкубировали с 0,2 мкг / мл конъюгированного с HRP козьего антикроличьего IgG, а затем снова промывали.Мембрану помещали в 10 мл одностадийного раствора Ultra TMB-Blotting Solution, и развитие окраски останавливали через 5 минут промыванием мембраны водой.


    4-хлор-1-нафтол (4CN) имеет молекулярную массу 178,6 и может использоваться для хромогенного обнаружения HRP в блоттинге и гистохимии. Этот осадок не так чувствителен или стабилен, как TMB и DAB, но растворимый в спирте осадок хорошо фотографируется и имеет отчетливый сине-фиолетовый цвет, который может быть использован при двойном окрашивании.

    Другим широко используемым субстратом HRP является 3,3′-диаминобензидин (DAB), который имеет молекулярную массу 214,1 и дает коричневый осадок в присутствии HRP и пероксида. Коричневый нерастворимый продукт легко образует хелат с четырехокисью осмия. Это свойство делает DAB идеальным для электронной микроскопии. Цвет, производимый DAB, может быть усилен добавлением металлов, таких как никель, медь, серебро и кобальт, которые образуют комплексы. Цвет, производимый комплексами металлов, более темный, чем цвет, производимый только DAB, что повышает чувствительность при окрашивании.

    Отдельные преимущества 4-CN и DAB часто объединяются в одну смесь субстратов Thermo Scientific Pierce CN / DAB Substrate. Подложка CN / DAB имеет отличную чувствительность, образуя темно-черный осадок, который хорошо фотографируется, и он хорошо работает в применениях вестерн-блоттинга и дот-блоттинга.


    Субстраты для вестерн-блоттинга хромогенной щелочной фосфатазы

    Нитро-синий тетразолий (NBT) с молекулярной массой 817. 6, является членом класса гетероциклических органических соединений, известных как соли тетразолия. При восстановлении соединение дает NBT-формазан, сильно окрашенный, нерастворимый в воде продукт. Субстрат широко используется для иммунохимических анализов и методов, поскольку цвет, производимый формазаном, является линейным и стабильным в широком динамическом диапазоне.

    Хромогенный вестерн-блоттинг с использованием субстрата NBT / BCIP. Идентичные гели и нитроцеллюлозные блоты образцов белка IL-6 (от 0,1 до 2 мкг на лунку) были исследованы и обнаружены с использованием идентичных реагентов и условий после отсутствия обработки (вверху) или обработки усилителем (внизу) мембраны. Окончательное обнаружение проводилось с помощью одностадийного раствора субстрата NBT / BCIP компании Thermo Scientific.


    5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) имеет молекулярную массу 433.6, и гидролиз щелочной фосфатазой (AP) приводит к сине-пурпурному осадку, который может осаждаться на нитроцеллюлозных или нейлоновых мембранах. BCIP можно использовать в качестве хромогенного субстрата как для иммуноблоттинга, так и для иммуногистохимических исследований.

    Идеальная система для блоттинга или окрашивания с AP — это комбинация NBT и BCIP. Вместе они образуют интенсивный черно-пурпурный осадок, который обеспечивает гораздо большую чувствительность, чем любой субстрат по отдельности. Эта реакция протекает с постоянной скоростью, что позволяет точно контролировать ее относительную чувствительность.NBT / BCIP обычно обеспечивает резкое разрешение полосы с небольшим фоновым окрашиванием мембраны.

    Схема реакции NBT / BCIP. BCIP гидролизуется AP с образованием промежуточного продукта, который подвергается димеризации с образованием красителя индиго.NBT восстанавливается до NBT-формазана двумя восстанавливающими эквивалентами, генерируемыми димеризацией.

    Хромогенные субстраты для вестерн-блоттинга с щелочной фосфатазой.


    Рекомендуемая литература

    Галлахер, С., Winston (системы переноса в баке), S.E., Fuller (системы переноса в баке), S.A. и Hurrell (системы переноса в баке; обратимое окрашивание белков), J. G. (2011) Иммуноблоттинг и иммунодетекция. Текущие протоколы клеточной биологии 52: 6.2: 6.2.1–6.2.28.

    реагентов для обнаружения вестерн-блоттинга | Thermo Fisher Scientific

    Обнаружение хемилюминесцентного вестерн-блоттинга

    Хемилюминесцентные субстраты популярны, потому что они обладают рядом преимуществ по сравнению с другими методами обнаружения.Эти преимущества позволили хемилюминесценции стать предпочтительным методом обнаружения в большинстве белковых лабораторий. Использование хемилюминесценции позволяет делать несколько экспозиций для получения наилучшего изображения. Реагенты обнаружения могут быть удалены, и весь блот может быть повторно зондирован для визуализации другого белка или для оптимизации обнаружения первого белка. Большой линейный диапазон отклика позволяет обнаруживать и количественно определять широкий диапазон концентраций белка. Что наиболее важно, хемилюминесценция обеспечивает наивысшую чувствительность из всех доступных методов обнаружения.

    Хемилюминесцентные субстраты для пероксидазы хрена (HRP) в большинстве своем представляют собой двухкомпонентные системы, состоящие из стабильного раствора пероксида и улучшенного раствора люминола. Чтобы получился рабочий раствор, два компонента смешивают вместе. При инкубации с блотом, на котором связаны антитела, конъюгированные с HRP (или другие зонды), происходит химическая реакция, излучающая свет с длиной волны 425 нм, который можно уловить с помощью рентгеновской пленки, устройств формирования изображений на ПЗС-камерах и фосфорных изображений, обнаруживающих хемилюминесценцию.Также легко доступны хемилюминесцентные субстраты для щелочной фосфатазы. Щелкните здесь, чтобы получить информацию о хемилюминесцентном вестерн-блоттинге.

    Флуоресцентный вестерн-блоттинг

    Флуоресцентные реагенты становятся все более популярными для вестерн-блоттинга, поскольку они обеспечивают большую экономию времени по сравнению с хемилюминесцентным детектированием и сокращение химических отходов по сравнению с хемилюминесцентными или хромогенными системами детектирования. Хотя пределы обнаружения все еще не так низки, как хемилюминесцентное обнаружение, флуоресцентное обнаружение имеет уникальное преимущество, так как позволяет анализировать несколько мишеней на одном и том же блоте одновременно без необходимости полоскания и повторного зондирования.

    Растущий спрос на мультиплексный вестерн-блоттинг стимулировал разработку многих новых флуоресцентных красителей (таких как конъюгаты Alexa Fluor Plus). Эти новые флуорофоры ярче и более фотостабильны, чем традиционные молекулы флуоресцеина и родамина, которые традиционно используются, и имеют более широкий диапазон неперекрывающихся спектров.Вместе с достижениями в области оборудования для цифровой визуализации эти новые флуорофоры позволяют проводить чрезвычайно эффективные анализы при вестерн-блоттинге. Щелкните здесь, чтобы получить информацию о флуоресцентном вестерн-блоттинге.

    Обнаружение хромогенного вестерн-блоттинга

    Хромогенные или осаждающие субстраты широко используются в течение многих лет и представляют собой самый простой и наиболее экономичный метод вестерн-блоттинга. Когда эти субстраты вступают в контакт с соответствующим ферментом (например,грамм. Щелочная фосфатаза-АР или пероксидаза хрена-HRP) они превращаются в нерастворимые окрашенные продукты, которые осаждаются на мембране. Полученная цветная полоса или пятно не требует специального оборудования для обработки или визуализации. Субстраты для хромогенного блоттинга доступны во множестве спецификаций и форматов, производя ряд окрашенных преципитатов. Подходящий выбор субстрата зависит от метки фермента и желаемой чувствительности. Подобно проявочной пленке, блот инкубируется в субстрате до тех пор, пока не будет достигнута желаемая степень проявления.В отличие от хемилюминесцентного вестерн-блоттинга окрашенный осадок, образованный хромогенными субстратами, не может быть легко удален для облегчения процедур повторного зондирования. Поэтому важно позволить реакции продолжаться до тех пор, пока цвет не станет удовлетворительным, а затем остановить реакцию.

    Низкая чувствительность хромогенных субстратов затрудняет оптимизацию для обнаружения белков с низким содержанием. Хотя реакции можно дать развиваться в течение нескольких часов или даже в течение ночи, это также позволяет продолжить развитие фонового сигнала.Там, где хромогенные субстраты не чувствительны, они идеальны для применений, где высока концентрация белка. Щелкните здесь, чтобы получить информацию о хромогенном вестерн-блоттинге.

    Как выбрать правильный метод обнаружения вестерн-блоттинга?

    Благодаря своей гибкости, вестерн-блоттинг может использоваться для широкого круга приложений в молекулярной биологии и биохимии, включая обнаружение посттрансляционных модификаций и проверку клонирования белков.Иммобилизованные мембраносвязанные белки обычно обнаруживают с помощью вторичных антител, которые конъюгированы с флуоресцентными молекулами (флуорофорами) или ферментом, таким как щелочная фосфатаза (AP) или пероксидаза хрена (HRP). Когда добавляется ферментный субстрат, образуется окрашенный осадок (колориметрическое определение) или хемилюминесцентный или флуоресцентный продукт, и световой сигнал улавливается. Используя размер и интенсивность цвета полосы белка, можно получить полуколичественную оценку белка.Новый набор для хромогенного вестерн-блоттинга позволяет быстро и визуально считывать результаты вестерн-блоттинга в неочищенном клеточном экстракте. Набор можно использовать для идентификации первичных мышиных антител на Вестерн-блоттинге с использованием иммунодетекции. Он содержит полный набор реагентов с оптимизированными реагентами, готовыми к использованию или готовыми к разбавлению.

    Обнаружение хемилюминесценции

    Хемилюминесцентные системы обнаружения используют энергию, выделяемую в реакциях репортерный фермент-субстрат в виде света, который является зарегистрированным сигналом.Два обычно используемых фермента-репортера — это HRP и AP. Выбор субстрата для хемилюминесцентного вестерн-блоттинга определяется тем, какой из указанных ферментов выбран. При использовании HRP выбираются реагенты на основе люминола. HRP в пероксидном буфере окисляет люминол до продукта в возбужденном состоянии, 3-аминофталата, который излучает световой сигнал с длиной волны 425 нм. При использовании АР реагенты на основе 1,2-диоксетана являются соседними субстратами АР. AP дефосфорилирует подложки на основе 1,2-диоксетана с образованием аниона фенолята диоксетана, который излучает световой сигнал с длиной волны 466 нм.Эти световые сигналы затем фиксируются на рентгеновских пленках или камерах с зарядовой связью (ПЗС), когда световой сигнал затухает до основного состояния. Хемилюминесцентные системы легко адаптируются к традиционным протоколам вестерн-блоттинга благодаря использованию конъюгированных с ферментом антител для активации светового сигнала. Как только конечный пользователь оптимизировал правильную концентрацию конъюгированного с ферментом антитела, вырабатывается временный хемилюминесцентный сигнал, который быстро затухает при исчерпании субстрата. Оба метода совместимы с нитроцеллюлозными или PVDF мембранными блотами.

    Одним из преимуществ хемилюминесцентных систем вестерн-блоттинга является их чувствительность. Реакции HRP-субстрат могут обнаруживать от 1 до 3 пг, а реакции AP-субстрат могут обнаруживать всего 10 пг белка. Учитывая короткоживущий характер хемилюминесцентных сигналов, были разработаны хемилюминесцентные субстраты-усилители (ECL), которые позволяют увеличить продолжительность сигнала, его интенсивность и чувствительность. Однако высокая чувствительность может быть невыгодной для образцов с высоким уровнем фона, и конечный пользователь все равно должен исследовать, как аффинность белка, первичного антитела, вторичного антитела и субстрата репортерного фермента будет варьироваться по характеристикам от одного образца к другому и соответствующие оптимизации.

    Методы, основанные на хемилюминесценции, предлагают гораздо более высокую чувствительность по сравнению с методами на основе колориметра, которые обнаруживают белки в диапазоне 100-500 пг, или методами на основе флуоресценции, которые ограничены диапазоном нанограмм (10-9). При этом более высокая чувствительность может быть невыгодной для образцов с высоким уровнем фона, и конечный пользователь все равно должен исследовать, как аффинность белка, первичного антитела, вторичного антитела и репортерного ферментного субстрата будет варьироваться по эффективности от одного образца к другому и сделайте соответствующие оптимизации.

    Еще одно преимущество хемилюминесцентных систем — это скорость, с которой может быть обнаружен белок. Сигналы, полученные с помощью пленочных или ПЗС-камер, предлагают короткое время экспозиции, которое составляет от 30 секунд до 5 минут в зависимости от того, используете ли вы HRP или AP соответственно. Пленки предназначены для одноразового использования и должны быть проявлены, прежде чем можно будет узнать, было ли время выдержки адекватным или нет, что может привести к разочаровывающим методам проб и ошибок. Современные системы визуализации ПЗС обеспечивают широкий динамический диапазон и множество различных экспозиций, что позволяет конечному пользователю анализировать широкий спектр концентраций белка в данном образце.Алгоритмы обработки изображений позволяют не только получить четкие определенные полосы и низкий фон, но и легко провести полуколичественный анализ результатов.

    Хромогенное обнаружение

    В отличие от хемилюминесцентного или флуоресцентного блоттинга, хромогенные субстраты не требуют специального оборудования для визуализации для визуализации результатов анализа. Хромогенное обнаружение — это экономичный и гораздо менее трудоемкий метод обнаружения целевого белка во время протокола вестерн-блоттинга.Подобно хемилюминесцентному обнаружению, хромогенное обнаружение использует вторичное антитело, конъюгированное с репортерным ферментом, которым является HRP или AP. Хромогенное обнаружение отличается от хемилюминесцентного обнаружения в способе получения детектируемого сигнала. Вместо реакции с хемилюминесцентным субстратом ферменты-репортеры будут реагировать с растворимым хромогенным субстратом с образованием окрашенного нерастворимого продукта, который является детектируемым сигналом. Этот сигнал осаждается непосредственно на мембране для блоттинга, образуя цветные полосы, которые могут быть видны глазом и информируют конечного пользователя о наличии или отсутствии интересующего белка.Подобно проявлению пленки, блот инкубируют до тех пор, пока не будет достигнута желаемая степень проявления, что требует некоторых проб и ошибок для оптимизации интенсивности сигнала. Первоначально конечный пользователь должен устать от продолжительной инкубации, поскольку это может усилить фоновый сигнал, который может скрыть обнаруживаемый сигнал. Однако за ферментативной реакцией можно наблюдать визуально, поэтому реакцию можно относительно легко остановить. Эта функция делает хромогенное обнаружение методом средней чувствительности, который не подходит для образцов с низким содержанием интересующего белка.

    Для хромогенных систем HRP типичными субстратами хромогена являются 3,3 ’, 5,5’-тетраметилбензидин (TMB), хлор-1-нафтол (4CN) и 3,3’-диаминобензидин (DAB). TMB реагирует с HRP в пероксидном буфере с образованием водорастворимого синего продукта, который подходит для приложений, требующих большого отношения сигнал / шум. 4CN производит отчетливый сине-пурпурный продукт, который можно использовать для двойного окрашивания, несмотря на отсутствие чувствительности или стабильности, обеспечиваемой TMB и DAB. DAB дает осадок коричневого цвета.Цвет, производимый DAB, усиливается за счет добавления металлов (никеля, меди, серебра и кобальта), которые образуют комплексы, которые приводят к более темному окрашиванию продукта и, таким образом, повышают чувствительность к окрашиванию.

    Для хромогенных AP-систем типичными субстратами хромогена являются нитросиний тетразолий (NBT) или 5-бром-4-хлориндолилфосфат (BCIP). NBT представляет собой гетероциклическую соль тетразолия, которая восстанавливается с образованием NBT-формазана, сильно окрашенного, нерастворимого в воде продукта, который является стабильным.Следовательно, продукт реакции не выцветает по сравнению с хромогенными продуктами фермента-субстрата HRP, которые могут исчезать под воздействием света. NBT гидролизуется AP и образует сине-фиолетовый осадок, который откладывается на нитроцеллюлозных мембранах. В отличие от хромогенных систем HRP, реакции AP можно инактивировать кислотными растворами, что позволяет многократно исследовать одну и ту же мембрану с помощью альтернативно окрашенных зондов антител. Системы AP по сравнению с системами HRP не требуют такой интенсивной химической очистки, которая может затруднить повторное зондирование мембраны для других целей.Однако в идеале хромогенный вестерн-блоттинг с AP использует комбинацию NBT и BCIP, что приводит к интенсивному черно-пурпурному осадку, который обеспечивает большую чувствительность к субстрату. Комбинации субстратов NBT / BCIP с АР дают четкие полосы с небольшим фоновым окрашиванием, что идеально для применения Вестерн-блоттинга.

    Набор для хромогенного вестерн-блоттинга использует преимущества ресурсов и времени. и простота хромогенного формата, а также повышенная чувствительность и гибкость AP-системы для предоставления конечным пользователям высокочувствительного и гибкого иммунодетектора с помощью уже оптимизированного, готового к использованию решения NBT / BCIP, которое используется с вторичными антителами против мыши, конъюгированными с фермент-репортер.В набор входят блокаторы / разбавители антител и промывочные буферы, совместимые с первичными мышиными антителами. Во время валидации продукта мы подтвердили, что время анализа составляет 2 часа, а время воздействия NBT / BCIP составляет всего минуту, а целевые белки с низким содержанием белка в лизатах клеток Jurkat (рис. 1 и 2).

    Рисунок 1: Визуальное считывание для быстрых результатов. Общий клеточный лизат из клеток Jurkat. Воздействие NBT / BCIP в течение 1 минуты.

    Рисунок 2: Обнаружение сложных белков. Клетки Jurkat обрабатывали 12,5 мкМ этопозидом в течение 18 часов. Загружали 12 мкг лизата на лунку.

    Кроме того, в этом наборе используется AP-система, которая дает конечным пользователям возможность мультиплексировать для нескольких представляющих интерес целей в одном образце, если конечный пользователь выбирает субстрат другого цвета (рис. 3).

    Рисунок 3: Адаптация к мультиплексному анализу. Клетки PANC-1, обработанные этопозидом. Загружено 20 мкг общего клеточного лизата. Тубулин мечен DAB. Каспаза, меченная NBT / BCIP.

    Флуоресцентное обнаружение

    Подобно системам обнаружения ферментов, при флуоресцентном обнаружении по-прежнему используются комплексы антиген-антитело для обнаружения конкретных белков, которые были иммобилизованы на блот-мембране после разделения с помощью гель-электрофореза. Флуоресцентный вестерн-блоттинг отличается от хемилюминесцентного детектирования использованием вторичных антител, связанных с флуорохромом. Результирующий сигнал обнаруживается с помощью системы визуализации флуоресценции, подобной эпифлуоресцентной микроскопии. Флуорохром, связанный с антителом, возбуждается источником света, и испускаемый флуоресцентный сигнал детектируется с помощью фильтров, зависящих от длины волны, и цифровых камер.

    Ключевой особенностью, которая отделяет флуоресцентное обнаружение от систем обнаружения ферментов, является то, что оно является более количественным.Хромогенное или хемилюминесцентное обнаружение предоставляет исследователю полуколичественный метод, поскольку конечный пользователь может определить присутствие или отсутствие интересующего его белка в своих образцах, а путем сравнения образцов вы можете сделать вывод об уровне экспрессии белка. Но при флуоресцентном обнаружении количество флуоресценции, производимой сигналом, прямо пропорционально количеству присутствующего белка. Однако, как и в других методах, конечному пользователю по-прежнему необходимо оптимизировать соотношение сигнал / фон.Первоначально необходимо учитывать важные характеристики флуорофора как при выборе флуорофора, так и при оптимизации сигнала, такие как эффективность излучения фотона после поглощения фотона источника света (квантовый выход) и насколько хорошо флуорофор поглощает свет на определенной длине волны (коэффициент экстинкции). В совокупности они будут указывать на относительную яркость флуорофора.

    Флуорофоры с более высокими квантовыми выходами и коэффициентами экстинкции обычно ярче.В ситуациях, когда конечный пользователь ожидает целей с низким содержанием в образце, высокая начальная яркость может быть полезной для обнаружения. При оптимизации сигнала также следует учитывать разницу в максимальных длинах волн возбуждения и излучения флуорофора (стоксов сдвиг). Флуорофоры с большими стоксовыми сдвигами могут минимизировать перекрытие между длинами волн возбуждения и излучения, увеличивая при этом интенсивность сигнала. Кроме того, может потребоваться учитывать степень мечения вторичного антитела флуорофором.Слишком слабая флуоресцентная маркировка и интенсивность флуоресценции будут генерировать слабый сигнал. Низкий сигнал также может быть из-за низкого уровня антигена или чрезмерной промывки блоттинг-мембраны, даже если для усиления сигнала используется вторичное антитело. Слишком сильная флуоресцентная маркировка и сигнал будет слабым, потому что реагент обнаружения будет инактивирован, и сигнал будет гасить из-за передачи энергии резонанса Форстера (FRET). Чтобы смягчить это, иногда используются конъюгаты красителей в дальнем красном и инфракрасном диапазонах, такие как Alexa Fluor 680 и 790, потому что они обеспечивают низкое тушение, низкую фоновую флуоресценцию с высоким коэффициентом экстинкции, что дает чувствительный и надежный сигнал.И последнее, но не менее важное: спектры возбуждения и излучения каждого флуорофора следует учитывать в мультиплексных вестернах, чтобы избежать перекрытия.

    Флуоресцентный вестерн-блот дает несколько преимуществ по сравнению с другими методами. Например, возможность легко мультиплексировать или использовать несколько флуорофоров разного цвета для одновременного зондирования и обнаружения нескольких белков на одном и том же блоте. Флуорофоры разного цвета предназначены для различения белков-мишеней. В отличие от методов на основе ферментов, нет необходимости химически очищать и повторно зондировать блот при просмотре нескольких мишеней.Кроме того, конечному пользователю не нужно учитывать влияние времени инкубации субстрата или экспонирования пленки на обнаружение четкого сигнала. Однако конечному пользователю необходимо учитывать возможность перекрестной реактивности и использовать первичные антитела от разных видов хозяев и вторичные антитела, которые перекрестно абсорбируются против других видов. Еще одно преимущество заключается в стабильности флуорофоров. Сигналы стабильны в течение нескольких недель или месяцев, что позволяет сохранять блоты для повторной визуализации в более поздний момент времени без значительной потери сигнала.

    Флуоресцентное обнаружение Хемилюминесцентное детектирование Хромогенное обнаружение
    Подложки Флуоресцентные красители и конъюгированные вторичные антитела Подложки AP и HRP Реагенты для определения цвета
    Обнаружение Инструменты для визуализации с соответствующими фильтрами или лазерами Пленка и проявитель КИПиА не требуются
    Продолжительность сигнала недель Часы месяцев
    Соображения Может одновременно обнаруживать несколько белков на одном блоте Превосходная чувствительность, широкий выбор материалов для печати Прямая визуализация без использования оборудования для обработки изображений или пленки

    Таблица 1. Методы обнаружения вестерн-блоттинга.

    Enzo Life Sciences предлагает тысячи антител против пептидов, целых или частичных белков, а также модифицированных пептидов или белков. Благодаря тысячам рецензируемых ссылок, нашей программе испытаний антител без беспокойства и экспертной технической поддержке вы можете рассчитывать на Enzo-антитела для получения надежных, последовательных и точных данных. Не стесняйтесь ознакомиться с нашими советами по успешному исследованию или нашими 10 советами по успешному вестерну. Кроме того, обратитесь в нашу службу технической поддержки для получения дополнительной помощи.

    Наука о кляксах Роршаха

    Когда психиатр Герман Роршах нанес чернила на бумагу, чтобы получить серию абстрактных узоров, мог ли он знать, что почти 100 лет спустя тест Роршаха станет нарицательным?

    Хотя использование теста Роршаха для диагностики психических заболеваний в основном осталось в прошлом, исследования этого теста продолжаются. На прошлой неделе были опубликованы две новые статьи о пятнах Роршаха, в том числе , фрактальный анализ самих изображений и исследование сканирования мозга с использованием фМРТ. Фрактальный анализ взят от Taylor et al. Университета Орегона, Юджин. Эти авторы сообщают, что пятна Роршаха с более низкой визуальной сложностью (в частности, с более низкой фрактальной размерностью, D) генерируют более разнообразные интерпретации в умах наблюдателей.

    Тейлор и др. скажем, что

    Природные объекты, фрактальные характеристики которых могут вызывать узнаваемые изображения, включают скальные поверхности, узоры береговой линии, облака и кратеры на Луне. В частности, многие облака имеют фрактальные границы, количественно оцениваемые как D = 1.3 (аналогично пятнам Роршаха) и хорошо известны тем, что вызывают восприятие в нашей повседневной жизни.

    К сожалению, корреляция между фрактальной размерностью и количеством восприятий имела размер выборки всего пять, потому что только половина из десяти пятен Роршаха была включена в анализ (поскольку другие включают цвета). Тем временем итальянские исследователи Лучано Джиромини и его коллеги провели исследование фМРТ, в котором 26 здоровым добровольцам показали полный набор пятен и попросили «посмотреть на каждое пятно и подумать, что это может быть, пытаясь увидеть только одну вещь на каждое пятно. design « Наблюдение за пятнами было связано с повсеместным увеличением активности мозга:

    Авторы продолжают обсуждать, что означают эти паттерны активности.Например:

    Задача Роршаха сильно активировала переднюю часть таламуса, большую часть легочной артерии и часть мамиллярных тел. Эти области являются частью лимбической системы и, как считается, способствуют восприятию и обработке эмоций, особенно в отношении памяти … Таким образом, с точки зрения оценки Роршаха, это открытие особенно интригует. По сути, это показывает, что просмотр чернильных пятен Роршаха при размышлении о том, чем они могут быть, активирует области мозга, которые участвуют в восприятии и обработке эмоций и эмоциональных воспоминаний…. Таким образом, наше исследование косвенно подтверждает идею о том, что шкалу Роршаха можно использовать для исследования способности и желания респондента сосредоточиться, говорить и / или иметь дело с эмоционально нагруженными стимулами, содержанием и / или воспоминаниями.

    Если честно, такая функциональная интерпретация изображений фМРТ имеет много общего с интерпретацией пятен Роршаха. Может быть, мы имеем дело с каплями Роршаха ? Однако здесь есть более серьезная проблема, заключающаяся в том, что активация мозга, вероятно, не была специфичной для просмотра изображений Роршаха, а вместо этого просто отражала нервную реакцию на любой сложный визуальный стимул.Это связано с тем, что исходным состоянием Giromini et al. Был крест фиксации, то есть видение + на экране. Перекрестный стимул менее сложен и меньше, чем изображение Роршаха (и менее красочен в случае 5 цветных пятен). Таким образом, мы не можем интерпретировать капли фМРТ как специфичные для Роршаха. Авторы признают это ограничение, но, похоже, не осознают, что оно фатально.

    Тейлор Р.П., Мартин Т.П., Монтгомери Р.Д., Смит Дж. Х., Миколич А. П., Бойдстон С., Сканнелл Британская Колумбия, Фэрбенкс М.С. и Спехар Б. (2017).Видеть формы в кажущихся случайными пространственных узорах: фрактальный анализ чернильных пятен Роршаха. PloS ONE, 12 (2) PMID: 28196082

    Giromini L, Viglione DJ Jr, Zennaro A и Cauda F (2017). Нейронная активность во время производства ответов Роршаха: исследование фМРТ. Psychiatry Research, 262, 25-31 PMID: 28208069

    Ремесленный нож: чернильные кляксы в стиле Роршаха своими руками

    Недавно Уилл изучала тест Роршаха в рамках своей учебной программы по психологии AP и показала мне, что на самом деле анализируется не то, ЧТО вы определяете в чернильном пятне, а КАК вы приходите к этой идентификации.Очевидно, психологов больше интересует ваш мыслительный процесс, восприятие, принятие решений и общение, чем то, думаете ли вы, что все это гитара, или две собаки, играющие в покер, или что-то еще.

    Что все действительно круто, но пока Уилл рассказывал мне все это, я в основном думал: «Ой, мы должны снова сделать чернильные кляксы!»

    Сидни пережила серьезную одержимость симметрией, когда ей было пять или шесть лет, поэтому в те дни мы тратили МНОГО времени вместе, делая чернильные кляксы.

    Вот, я позволю ей объяснить вам, как создаются чернильные кляксы:

    В таком случае вполне уместно, что я выкопал остатки этих семилетних красок BioColor в недавний прекрасный полдень. чтобы мы с детьми смогли вернуться к этому давно полюбившемуся ремеслу.

    Можете ли вы поверить, что Сид даже не помнил, что мы делали это раньше?!? Как с течением времени могут исчезнуть воспоминания о том, что мы когда-то любили …

    Чтобы избежать складки в середине отпечатка, на этот раз мы опробовали другую технику. Я снова позволю Сиду продемонстрировать:

    1. Отрежьте кусок алюминиевой фольги или вощеной бумаги до нужного размера, затем согните его по вертикали. Добавляем краску:


    2. Сложите фольгу или вощеную бумагу по складке:
    3.Откройте его, чтобы увидеть симметричное изображение!
    4. Положите поверх краски кусок плотной бумаги. Мы использовали эту акварельную бумагу:
    5. С помощью брайера (или скалки, предназначенной для пластилина) разгладьте бумагу, убедившись, что она хорошо контактирует с краской:
    6. Осторожно поднимите бумагу и полюбуйтесь своим искусством (или разочаруйтесь в нем)!
    Это был довольно расслабляющий и довольно интересный способ провести часть приятного дня!


    Хотя, честно говоря, я не думаю, что конечный результат страницы без вертикальной складки стоил дополнительного времени и материалов, затраченных на печать на алюминиевой фольге в первую очередь:

    В традиционном наборе чернильных пятен одни являются черными чернилами на белой бумаге, другие — красными и черными чернилами на белой бумаге —


    — и некоторые разноцветные.Детей больше всего интересовали разноцветные кляксы:





    Было бы весело составить правильный набор из них, а затем попытаться анализировать друг друга!

    Если вас интересует Роршах и его тест чернильными пятнами, вот еще пара ресурсов: