От формирования к штурму

Чтобы установить четкие цели для группы на этом первом этапе, создайте устав команды .И помогать членам команды ставить личные цели чтобы они могли видеть, как их работа впишется в общую картину.

Стадия формирования — это еще и знакомство людей друг с другом. Если вы работаете удаленно, попробуйте виртуальную адаптацию упражнения для укрепления групповой связи и поддержки вашего видения.

От штурма до нормирования

Storming может создать или разрушить команду, поэтому важно, чтобы вы установили процессы для отслеживания прогресса и успеха задач.

Группа также должна чувствовать себя в безопасности, выдвигая идеи. Чтобы укрепить командное доверие , попробуйте попросить помощи по задачам. Таким образом вы побудите людей задуматься о том, что они могут предложить и что им нужно от других членов команды.

Не оставлять командный конфликт без контроля, но помните, что небольшое трение может быть хорошим делом — оно может выявить недостатки, которые группа может исправить вместе, и, в конечном итоге, приведет к инновациям.

Но, возможно, вам придется помочь более спокойным членам команды высказать свое мнение.Чтобы избежать доминирования громких людей на личных или виртуальных встречах команды , спросите и выслушайте точку зрения каждого.

От нормирования к исполнению

Заставьте свою команду сплотиться с помощью личных или виртуальных упражнений по тимбилдингу . Эти социальные связи особенно важны сейчас, поскольку все больше из нас работают из дома. Так что поддерживайте их в течение всего периода нормализации и после.

Используйте регулярные личные встречи, чтобы побудить людей отступить, пересмотреть свои цели и взять на себя ответственность.

Выполнение до отсрочки

Когда команда перешла на стадию исполнения, вы можете сосредоточиться на других целях и новых областях, которые принесут пользу бизнесу. Освободите больше времени для себя и повысьте вовлеченность команды, делегируя задачи и проекты.

Вы также должны уделять время личному развитию группы. Обсудите со своей командой, какие возможности и ресурсы им доступны, например, инструменты Mind Tools.

Перенос (или траур)

Найдите время, чтобы отметить достижения команды — обмен положительным опытом облегчит вам задачу, если вы снова будете работать с одними и теми же людьми в будущем.

Если кто-то из членов команды неуверен в том, что ждет впереди, повысьте его уверенность и карьерные перспективы, похвалив их на собраниях компании. И предложите предоставить LinkedIn рекомендации и ссылки, если они будут двигаться дальше.

Вы также можете попросить группу предоставить 360-градусный отзыв размышлять, учиться и лучше управлять будущими командами.

Ключевые моменты

Психолог Брюс Такман описал, как команды проходят этапы, известные как формирование, штурм, нормирование, исполнение и перерыв (или оплакивание).

Вы можете использовать модель Такмана, чтобы помочь вашей команде работать лучше. Сначала определите, на каком этапе находится ваша команда, а затем воспользуйтесь нашими советами, чтобы перемещать их по этапам.

Помните, команды тоже могут ускользнуть на сцену. Используйте модель Такмана, чтобы постоянно проверять, где находится ваша команда, и вносить любые необходимые изменения, чтобы вернуться на курс.

Прошлое и настоящее

Извлечение ДНК, РНК и белка — основной метод, используемый в молекулярной биологии.Эти биомолекулы можно выделить из любого биологического материала для последующих процессов, аналитических или препаративных целей. В прошлом процесс экстракции и очистки нуклеиновых кислот был сложным, длительным, трудоемким и ограниченным с точки зрения общей производительности. В настоящее время существует множество специализированных методов, которые можно использовать для извлечения чистых биомолекул, например протоколы на основе растворов и колонок. Ручной метод, безусловно, прошел долгий путь с течением времени с различными коммерческими предложениями, которые включали полные наборы, содержащие большинство компонентов, необходимых для выделения нуклеиновой кислоты, но большинство из них требует повторных этапов центрифугирования с последующим удалением супернатантов в зависимости от типа образца и дополнительная механическая обработка.Спрос на автоматизированные системы, предназначенные для средних и крупных лабораторий, за последние годы вырос. Это альтернатива трудоемким ручным методам. Технология должна обеспечивать высокую пропускную способность образцов; выход, чистота, воспроизводимость и масштабируемость биомолекул, а также скорость, точность и надежность анализа должны быть максимальными при минимальном риске перекрестного загрязнения.

Извлечение биомолекул, ДНК, РНК и белка — наиболее важный метод, используемый в молекулярной биологии [1].Это отправная точка для последующих процессов и разработки продуктов, включая диагностические комплекты. ДНК, РНК и белок могут быть выделены из любого биологического материала, такого как живые или консервированные ткани, клетки, вирусные частицы или другие образцы для аналитических или препаративных целей [1].

Две категории, которые участвуют в очистке ДНК, включают выделение конструкций рекомбинантной ДНК, таких как плазмиды или бактериофаги, и выделение хромосомной или геномной ДНК от прокариотических или эукариотических организмов [2].Как правило, для успешной очистки нуклеиновых кислот требовалось четыре важных этапа: эффективное разрушение клеток или тканей; денатурация нуклеопротеидных комплексов; инактивация нуклеаз, например, РНКазы для экстракции РНК и ДНКазы для экстракции ДНК; вдали от загрязнения [2]. Нуклеиновая кислота-мишень не должна содержать примесей, включая белки, углеводы, липиды или другие нуклеиновые кислоты, например ДНК без РНК или РНК без ДНК [3]. Качество, а также целостность выделенной нуклеиновой кислоты будут напрямую влиять на результаты всех последующих научных исследований [4].

С другой стороны, РНК является нестабильной молекулой и имеет очень короткий период полураспада после извлечения из клетки или тканей [5]. Существует несколько типов встречающихся в природе РНК, включая рибосомную РНК (рРНК) (80–90%), информационную РНК (мРНК) (2,5–5%) и транспортную РНК (тРНК) [3]. Особая осторожность и меры предосторожности требуются для выделения РНК, поскольку она подвержена деградации [3, 6]. РНК особенно нестабильна из-за повсеместного присутствия РНКаз, которые представляют собой ферменты, присутствующие в крови, всех тканях, а также в большинстве бактерий и грибов в окружающей среде [3, 5] . Сильные денатуранты всегда использовались при выделении интактной РНК для ингибирования эндогенных РНКаз [2]. Экстракция РНК основана на хорошей лабораторной технике и методе без РНКазы. РНКаза термостабильна и повторно складывается после тепловой денатурации. Их трудно инактивировать, поскольку они не требуют кофакторов [2]. Наиболее распространенные методы выделения можно разделить на два класса: использование 4 M тиоцианата гуанидиния и использование фенола и SDS [2].

Очистка белков — одна из наиболее важных частей в исследованиях белков для понимания их функции, поскольку они могут частично или полностью участвовать в любой деятельности по синтезу ДНК.Очистка белка необходима для определения его уникальных характеристик, включая размер, заряд, форму и функцию [7]. Экстракция на основе клеток — это начальный этап почти любой очистки белка. Белок может быть извлечен несколькими методами, такими как лизис детергентом, усилие сдвига, обработка солью с низким содержанием ионов (высаливание) и быстрые изменения давления, которые направлены на ослабление и разрушение мембран, окружающих клетку, чтобы позволить белкам уйти [7 ]. При работе с белками следует учитывать некоторые факторы.Обычно экстракция белка выполняется при очень низкой температуре (), поскольку белки легко денатурируются после того, как они высвобождаются из клеток. Состояние буфера — один из основных факторов, которые необходимо учитывать. Рекомендуется поддерживать определенные буферные условия из-за чувствительности белков к изменениям pH окружающей среды [4]. Чистота воды будет влиять на выход конечных продуктов, так как неочищенная вода содержит много микроорганизмов или протеаз, которые приводят к деградации белка [4].Ингибитор белка, который может существовать в растворе или буферах, вызывает гидролиз белков. Детергент, еще один важный фактор, которым нельзя пренебрегать при очистке белка, состоит из гидрофобной части линейного или разветвленного углеводородного «хвоста» и гидрофильной «головы» [4]. Они солюбилизируют мембранный белок и представляют собой амфифатические молекулы, которые образуют мицеллы с гидрофильной головкой белков [4]. Восстановители будут добавлены в раствор или буфер для экстракции и очистки белка, чтобы избежать потери активности белков или ферментов, вызванной окислением.Хранение белков важно, поскольку период полураспада белка обычно зависит от температуры хранения [4].

Для очистки белка требуется специальный анализ. Для очистки белка должен быть известен быстрый и простой метод анализа, чтобы можно было определить известную молекулярную массу, удельную аффинность или иммуноаффинность интересующего неферментативного белка с помощью соответствующего метода [7]. Есть несколько методов, обычно используемых для очистки белка. Это ионообменная хроматография, гель-фильтрация, аффинная хроматография и гель-электрофорез [4].

2. История

2.1. Экстракция нуклеиновой кислоты

Самое первое выделение ДНК было сделано швейцарским врачом Фридрихом Мишером в 1869 году [8] . Он надеялся разгадать фундаментальные принципы жизни, определить химический состав клеток. Он пытался изолировать клетки из лимфатических узлов для своего эксперимента, но чистота лимфоцитов была трудной и невозможно было получить в достаточных количествах. Поэтому он перешел на лейкоциты, где получил их из гноя на собранных хирургических повязках.

Первоначально Мишер сосредоточился на различных типах белков, из которых состоят лейкоциты, и показал, что белки являются основными компонентами цитоплазмы клетки. Во время своих тестов он заметил, что при добавлении кислоты из раствора выпадало вещество, которое снова растворялось при добавлении щелочи. Это был первый раз, когда он получил неочищенный осадок ДНК.

Чтобы отделить ДНК от белков в экстрактах своих клеток, Мишер разработал новый протокол для отделения ядер клеток от цитоплазмы, а затем выделил ДНК.Однако его первый протокол не дал достаточно материала для продолжения дальнейшего анализа. Ему пришлось разработать второй протокол для получения большего количества очищенного нуклеина, который позже его ученик Ричард Альтман назвал «нуклеиновой кислотой» [8].

2.2. Экстракция белка

В восемнадцатом веке белки были известны как отдельный класс биологических молекул Антуаном Фуркроем и другими. Они различали эту молекулу по ее способности коагулировать под воздействием тепла или кислоты.Однако первое описание белка было выполнено голландским химиком Герхардусом Йоханнесом Малдером в 1893 году [9]. Его исследования состава веществ животного происхождения, в основном фибрина, альбумина и желатина, показали присутствие углерода, водорода, кислорода и азота [9]. Более того, он признал, что сера и фосфор иногда присутствуют в животных веществах, состоящих из большого количества атомов, и установил, что эти «вещества» являются макромолекулами [9].

Большинство ранних исследований было сосредоточено на белках, которые можно было очищать в больших количествах.Например, кровь, яичный белок и различные токсины. Большинство белков трудно очистить в количествах, превышающих миллиграммы, даже с помощью современных высокотехнологичных методов. Большинство методов очистки белков были разработаны в рамках проекта, возглавляемого Эдвином Джозефом Коном, ученым-белком, во время Второй мировой войны. Он отвечал за очистку крови и разработал методы выделения фракции сывороточного альбумина из плазмы крови, которая важна для поддержания осмотического давления в кровеносных сосудах, что помогает солдатам выжить [10].

3. Текущая тенденция

После судьбоносного события, когда Мишеру удалось получить ДНК из клетки, многие другие последовали его примеру, что привело к дальнейшему развитию протокола выделения и очистки ДНК. Первоначальные рутинные лабораторные процедуры для экстракции ДНК были разработаны на основе стратегий центрифугирования в градиенте плотности. Мезельсон и Шталь использовали этот метод в 1958 г., чтобы продемонстрировать полуконсервативную репликацию ДНК [3]. В более поздних процедурах использовались различия в растворимости больших хромосомных ДНК, плазмид и белков в щелочном буфере [3].

В настоящее время существует множество специализированных методов извлечения чистой ДНК, РНК или белка. Как правило, они делятся на протоколы на основе решений или на основе столбцов. Большинство из этих протоколов были преобразованы в коммерческие наборы, упрощающие процессы экстракции биомолекул.

3.1. Тип экстракции нуклеиновой кислоты

3.1.1. Стандартный метод

Экстракция тиоцианата гуанидиния-фенола-хлороформа гуанидиния
Соль является обычной примесью в образцах нуклеиновых кислот.Всегда требовалось удалить его из образцов нуклеиновой кислоты до того, как можно будет проводить какие-либо последующие процессы и анализ. Следовательно, для обессоливания образца, содержащего нуклеиновую кислоту, необходимы однократные или многократные стадии разделения и / или очистки [11]. Общие этапы очистки нуклеиновых кислот включают лизис клеток, который разрушает клеточную структуру с образованием лизата, инактивацию клеточных нуклеаз, таких как ДНКаза и РНКаза, и отделение желаемой нуклеиновой кислоты от клеточного мусора [2].Органический растворитель — экстракция фенол-хлороформ является одним из примеров, который широко используется для выделения нуклеиновой кислоты.
Хотя фенол, легковоспламеняющаяся, едкая и токсичная карболовая кислота, может быстро денатурировать белки, он не полностью подавляет активность РНКазы [12]. Эту проблему можно решить, используя смесь фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1). Белки, липиды, углеводы и остатки клеток удаляются путем экстракции водной фазы органической смесью фенола и хлороформа [12, 13].При добавлении фенола и хлороформа образуется двухфазная эмульсия. Затем гидрофобный слой эмульсии осаждается на дне, а гидрофильный слой — наверху путем центрифугирования [3]. Собирают верхнюю фазу, содержащую ДНК, и ДНК можно осаждать из супернатанта путем добавления этанола или изопропанола в соотношении 2: 1 или 1: 1 и высокой концентрации соли [3]. Осадок ДНК собирают центрифугированием, избыток соли промывают 70% этанолом и центрифугируют, чтобы удалить надосадочную жидкость этанола.Затем осадок ДНК растворяют в буфере ТЕ или стерильной дистиллированной воде [3].
Использование изотиоцианата гуанидиния для экстракции РНК впервые было упомянуто Ulrich et al. (1977). Метод был трудоемким. Поэтому он был заменен одностадийной техникой, известной как экстракция тиоцианата гуанидиния-фенол-хлороформ, Хомчинским и Сакки (1987) [12], посредством которой гомогенат экстрагируется фенолом / хлороформом при пониженном pH. Тиоцианат гуанидиния — хаотропный агент, используемый при расщеплении белков.Принцип этого одностадийного метода заключается в том, что РНК отделяется от ДНК после экстракции кислым раствором, состоящим из тиоцианата гуанидиния, ацетата натрия, фенола и хлороформа [13]. В кислых условиях общая РНК будет оставаться в верхней водной фазе всей смеси, в то время как ДНК и белки останутся в межфазной или нижней органической фазе. Затем проводят восстановление общей РНК путем осаждения изопропанолом [12].

Метод щелочной экстракции
Щелочной лизис использовали для выделения плазмидной ДНК и E.coli [12]. Он хорошо работает со всеми штаммами E. coli и с бактериальными культурами размером от 1 мл до более 500 мл в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). Принцип метода основан на селективной щелочной денатурации высокомолекулярной хромосомной ДНК, в то время как ковалентно замкнутая кольцевая ДНК остается двухцепочечной [14]. Бактериальные белки, разрушенные клеточные стенки и денатурированная хромосомная ДНК объединены в большие комплексы, покрытые додецилсульфатом.Плазмидную ДНК можно выделить из супернатанта после удаления денатурированного материала центрифугированием.

CTAB Extraction Method
Для экстракции растений первым шагом, который необходимо сделать, является измельчение образца после его замораживания жидким азотом. Цель выполнения этого шага — разрушить материал клеточной стенки образца и предоставить доступ к нуклеиновой кислоте, в то время как вредные клеточные ферменты и химические вещества остаются инактивированными. После измельчения образца его можно ресуспендировать в подходящем буфере, таком как CTAB.
Бромид цетилтриметиламмония (CTAB) — неионный детергент, который может осаждать нуклеиновые кислоты и кислые полисахариды из растворов с низкой ионной силой [15]. Между тем в этих условиях белки и нейтральные полисахариды остаются в растворе. В растворах с высокой ионной силой CTAB не осаждает нуклеиновые кислоты и образует комплексы с белками. Поэтому CTAB полезен для очистки нуклеиновой кислоты от организмов, которые продуцируют большие количества полисахаридов, таких как растения и некоторые грамотрицательные бактерии [15].
В этом методе также используются органические растворители и осаждение спиртом на более поздних этапах [12]. Нерастворимые частицы удаляют центрифугированием для очистки нуклеиновой кислоты. Растворимые белки и другие материалы разделяются путем смешивания с хлороформом и центрифугирования. После этого нуклеиновую кислоту необходимо осадить из надосадочной жидкости и тщательно промыть для удаления загрязняющих солей. Затем очищенную нуклеиновую кислоту ресуспендируют и хранят в буфере ТЕ или стерильной дистиллированной воде.

Градиентное центрифугирование бромида этидия () -хлорида цезия ()
Градиентное центрифугирование — это сложный, дорогой и трудоемкий метод по сравнению с другими протоколами очистки.Это требует крупномасштабного бактериального культивирования. Следовательно, он не подходит для минипрепаратов плазмидной ДНК [4]. Нуклеиновые кислоты можно концентрировать центрифугированием в градиенте после осаждения спиртом и ресуспендирования. Интеркаляция изменяет плавающую плотность молекулы в высокомолярные ковалентно замкнутые круговые молекулы, которые будут накапливаться при более низких плотностях градиента, поскольку они включают меньше на пару оснований по сравнению с линейными молекулами. После экстракции гидрофобные вещества удаляют соответствующими гидрофобными растворителями.Очищенную нуклеиновую кислоту переосаждают спиртом [1].

Очистка поли РНК с помощью хроматографии Oligp (dT) -целлюлозы
Поли РНК является матрицей для трансляции белка, и большинство эукариотических мРНК несут ее участки на своих 3’-концах [4, 15]. Он составляет от 1 до 2% от общей РНК и может быть разделен с помощью аффинной хроматографии на олиго (dT) -целлюлозе. Поли (A) хвосты образуют стабильные гибриды РНК-ДНК с короткими цепями олиго (dT), которые прикрепляются к различным поддерживающим матрицам [4, 15].В хроматографический буфер необходимо добавить большое количество соли для стабилизации дуплексов нуклеиновых кислот, поскольку образуются только несколько пар оснований dT-A. Буфер с низким содержанием соли используется после того, как неполиаденилированные РНК были отмыты от матрицы. Этот буфер помогает дестабилизировать двухцепочечные структуры и элюировать поли РНК из смолы [15].
Существует два метода, обычно используемых при выборе поли РНК — колоночная хроматография на олиго (dT) колонках и периодическая хроматография. Колоночная хроматография обычно используется для очистки больших количеств (> 25 г) нерадиоактивной РНК поли (A) ⁺ , выделенной из клеток млекопитающих.При работе с небольшими количествами (<50 г) тотальной РНК млекопитающих предпочтительным методом является периодическая хроматография. Его можно использовать, когда нужно обработать много образцов РНК, радиоактивных или нет. Периодическая хроматография проводится с олиго (dT) целлюлозой тонкой очистки при оптимальных температурах для связывания и элюирования [15].

3.1.2. Твердофазная экстракция нуклеиновых кислот

Твердофазная очистка нуклеиновых кислот можно найти в большинстве имеющихся на рынке коммерческих наборов для экстракции.Он обеспечивает быструю и эффективную очистку по сравнению с традиционными методами [16]. Многие проблемы, связанные с экстракцией жидкость-жидкость, такие как неполное разделение фаз, можно предотвратить. Твердофазная система будет поглощать нуклеиновую кислоту в процессе экстракции в зависимости от pH и содержания соли в буфере. Процесс абсорбции основан на следующих принципах: связывающее водород взаимодействие с гидрофильной матрицей в хаотропных условиях, ионный обмен в водных условиях посредством анионита, а также механизмы сродства и исключения по размеру.

Твердофазную очистку обычно проводят на спин-колонке, работающей под действием центробежной силы [17]. Этот метод позволяет быстро очистить нуклеиновую кислоту по сравнению с обычными методами. Матрицы из диоксида кремния, частицы стекла, диатомовая земля и анионообменные носители являются примерами, которые использовались в методе твердофазной экстракции в качестве твердого носителя. Четыре ключевых этапа твердофазной экстракции — это лизис клеток, адсорбция нуклеиновых кислот, промывка и элюция [6].

Первым шагом в процессе твердофазной экстракции является подготовка колонки для адсорбции пробы.Кондиционирование колонки может быть выполнено с использованием буфера при определенном pH для преобразования поверхности или функциональных групп твердого вещества в определенную химическую форму. [17]. Затем образец, который был разрушен с использованием буфера для лизиса, наносится на колонку. Желаемая нуклеиновая кислота будет абсорбироваться колонкой с помощью высокого pH и концентрации соли связывающего раствора [17]. Другие соединения, такие как белок, также могут иметь прочную специфическую связь с поверхностью колонки. Эти загрязнения могут быть удалены на стадии промывки с использованием промывочного буфера, содержащего конкурентный агент [17].На стадии элюирования вводится ТЕ-буфер или вода, чтобы высвободить нужную нуклеиновую кислоту из колонки, чтобы ее можно было собрать в очищенном состоянии [17]. Обычно на этапах промывки и элюирования процесса очистки требуется быстрое центрифугирование, вакуумная фильтрация или разделение колонок.

Были описаны твердофазная экстракция нуклеиновой кислоты в смешанном слое и ее использование для выделения нуклеиновой кислоты [18]. Твердые фазы смешанного слоя по настоящему изобретению представляют собой смеси, по меньшей мере, двух различных твердых фаз, могут быть твердыми или полутвердыми, пористыми или непористыми.Каждая твердая фаза может связываться с нуклеиновой кислотой-мишенью в различных условиях раствора и высвобождать нуклеиновую кислоту в аналогичных условиях элюирования [18].

Матрицы кремнезема
Основой для большинства продуктов, связанных с очисткой нуклеиновых кислот, являются уникальные свойства матриц кремнезема для избирательного связывания ДНК. Типы материалов из диоксида кремния, включая частицы стекла, такие как стеклянный порошок, частицы диоксида кремния и стеклянные микроволокна, полученные путем измельчения фильтровальной бумаги из стекловолокна, включая диатомовую землю [19].Матрица из гидратированного диоксида кремния, которую получали кипячением диоксида кремния в гидроксиде натрия или гидроксиде калия при молярном соотношении от примерно 2: 1 до 10: 1 в течение по меньшей мере примерно 48 часов, была введена в процесс очистки ДНК. ДНК связывается с неорганической матрицей и выделяется в нагретой воде [20].
Принцип очистки матриц кремнезема основан на высоком сродстве отрицательно заряженной основной цепи ДНК к положительно заряженным частицам кремнезема [21]. Натрий играет роль катионного мостика, который притягивает отрицательно заряженный кислород в фосфатном остове нуклеиновой кислоты [22].Катионы натрия разрывают водородные связи между водородом в воде и отрицательно заряженными ионами кислорода в кремнеземе в условиях высокой концентрации соли (pH ≤7) [22]. ДНК прочно связана, и тщательная промывка удаляет все загрязнения. Очищенные молекулы ДНК могут быть элюированы при низкой ионной силе (pH ≥7) позже с использованием буфера ТЕ или дистиллированной воды [21].
Известно, что, помимо матриц кремнезема, нитроцеллюлозные и полиамидные мембраны, такие как нейлоновые матрицы, связываются с нуклеиновыми кислотами, но с меньшей специфичностью.Эти материалы часто используются в качестве твердофазных матриц для переноса нуклеиновых кислот и гибридизации [23]. Полиамидные матрицы более долговечны, чем нитроцеллюлоза, и, как известно, необратимо связывают нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты можно иммобилизовать на полиамидных матрицах в буфере с низкой ионной силой [23].

Стеклянная частица
Стеклянные частицы, порошок и шарики пригодны для очистки нуклеиновых кислот. Например, выделение ДНК из агарозных гелей включает использование хаотропных солей для облегчения связывания ДНК с обычным силикатным стеклом, бесцветным стеклом и боросиликатным стеклом (стекловолоконный фильтр).Адсорбция нуклеиновой кислоты на стеклянную подложку, скорее всего, происходит по механизму и принципу, аналогичному адсорбционной хроматографии [24]. Очистку нуклеиновых кислот можно также проводить на смеси силикагеля и стекла [19]. В этом изобретении было обнаружено, что смесь силикагеля и стеклянных частиц может использоваться для отделения нуклеиновой кислоты от других веществ в присутствии раствора хаотропных солей.

Диатомовая земля
Диатомовая земля, также известная как кизельгур или диатомит, содержит до 94% кремнезема [25].Он использовался для фильтрации и в хроматографии, и он полезен для очистки плазмид и другой ДНК путем иммобилизации ДНК на ее частицах в присутствии хаотропного агента. Полученная ДНК, связанная с диатомовой землей, затем промывается спиртосодержащим буфером. Затем спиртосодержащий буфер удаляется, и ДНК элюируется малосолевым буфером или дистиллированной водой [25].

Очистка нуклеиновых кислот на основе магнитных шариков
Магнитное разделение — это простой и эффективный способ, который в настоящее время используется для очистки нуклеиновых кислот.Многие магнитные носители сейчас коммерчески доступны. Частицы, обладающие магнитным зарядом, могут быть удалены с помощью постоянного магнита в приложении магнитного поля. Часто для процесса выделения используются магнитные носители с иммобилизованными аффинными лигандами или полученные из биополимера, демонстрирующего сродство к целевой нуклеиновой кислоте. Например, магнитные частицы, которые производятся из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или магнитных частиц на основе неорганических магнитных материалов, таких как оксид железа с модифицированной поверхностью.Для связывания нуклеиновых кислот предпочтительно использовать материалы с большой площадью поверхности. Материалы с магнитными частицами, такие как шарики, более предпочтительны в качестве основы в процессе изоляции из-за их большей связывающей способности. Процесс связывания нуклеиновой кислоты может поддерживаться нуклеиновой кислотой, «обертывающей» подложку. Магнит может быть приложен к стороне сосуда, который содержит смесь образцов для агрегирования частиц у стенки сосуда и выливания остатка образца [26].
Частицы, обладающие магнитными или парамагнитными свойствами, используются в изобретении, где они заключены в полимер, такой как намагничивающаяся целлюлоза [27]. В присутствии определенных концентраций соли и полиалкиленгликоля намагничивающаяся целлюлоза может связываться с нуклеиновыми кислотами. Небольшая нуклеиновая кислота требует более высоких концентраций соли для прочного связывания с намагничивающимися частицами целлюлозы. Следовательно, концентрацией соли можно выборочно управлять для высвобождения нуклеиновой кислоты, связанной с намагничивающейся целлюлозой, в зависимости от размера.Намагничивающаяся целлюлоза, связанная с нуклеиновой кислотой, будет промыта подходящим промывочным буфером перед их контактом с подходящим элюирующим буфером для отделения желаемой нуклеиновой кислоты от целлюлозы. Отделение намагничивающейся целлюлозы от надосадочной жидкости на всех этапах очистки может быть выполнено путем приложения магнитного поля, которое притягивает или притягивает их к стенке сосуда [27]. Намагничивающаяся целлюлоза, используемая в этом изобретении, имеет содержание оксида железа примерно до 90% по массе от общей массы целлюлозы.Магнитный компонент целлюлозы также может быть заменен другими магнитными соединениями, такими как оксид железа или оксид никеля [27].
Набор для экстракции, основанный на принципе очистки нуклеиновых кислот с помощью магнитных шариков, коммерчески доступен на рынке [28]. Особенностью этого набора является то, что поставляемые реагенты предназначены для использования с магнитными инструментами. Этот магнитный инструмент рекомендуется использовать при работе в формате микропробирки. Это практичное устройство для разделения на основе технологии магнитных частиц.Набор не требует каких-либо органических растворителей и исключает необходимость повторного центрифугирования, вакуумной фильтрации или разделения колонок. Протокол основан на модифицированной процедуре щелочного лизиса с последующим связыванием нуклеиновой кислоты с магнитными частицами. Магнитный инструмент используется для захвата магнитных частиц со связанной нуклеиновой кислотой, а загрязнения удаляются промыванием с помощью предусмотренного промывочного буфера. Затем нуклеиновая кислота элюируется с магнитных частиц буфером для элюции [28].
Другой набор для экстракции работает по тому же принципу, что и описанная выше экстракция, в которой для очистки нуклеиновых кислот использовалась технология магнитных частиц [29]. Он сочетает в себе скорость и эффективность очистки ДНК на основе диоксида кремния с удобством работы с магнитными частицами. Магнитный стержень, защищенный крышкой стержня, используется для захвата магнитных частиц. Он попадает в сосуд с образцами и притягивает магнитные частицы. Затем крышка магнитного стержня помещается над другим сосудом, и магнитные частицы высвобождаются [29].
Очистка нуклеиновой кислоты с использованием гранул диоксида циркония — это еще один тип очистки на основе магнитных гранул. Эти микросферические парамагнитные шарики имеют большую доступную поверхность связывания и могут быть диспергированы в растворе. Эта характеристика позволяла тщательно связывать, промывать и элюировать нуклеиновую кислоту. В комплекте для выделения полной нуклеиновой кислоты, в котором используется эта технология очистки нуклеиновых кислот, используется механическое разрушение образцов гранулами диоксида циркония в растворе на основе тиоцианата гуанидиния, который не только высвобождает нуклеиновую кислоту, но и инактивирует нуклеазу в матрице образца [ 30].После стадии лизиса образцы разбавляются изопропанолом. Парамагенетические гранулы добавляют к образцам для связывания нуклеиновых кислот. Смесь гранул и нуклеиновой кислоты иммобилизуют на магнитах и ​​промывают для удаления белка и загрязнений. Удаление остаточного связывающего раствора выполняется вторым промывочным раствором, и, наконец, нуклеиновая кислота элюируется буфером с низким содержанием соли [30].
Твердофазная технология на основе парамагенетических шариков с обратимой иммобилизацией была использована в системе очистки ПЦР для получения качественной ДНК.Это требует простого протокола без центрифугирования и фильтрации. ПЦР-ампликоны связываются с парамагенетическими частицами, которые выводят их из раствора, позволяя смывать такие загрязнители, как dNTP, праймеры и соли [31].
Магнитный олиго (dT) шарик является альтернативой другим олиго (dT) матрицам для очистки поли РНК из образца тотальной РНК [4]. Поли РНК можно экстрагировать путем введения магнитных шариков, покрытых олиго (dT). РНК с поли-А-хвостом присоединяется к олиго (dT). Затем шарики будут вытягиваться на дно пробирки, удаляя мРНК непосредственно из общей РНК.Специально обработанные магнитные шарики минимизируют неспецифическое связывание других нуклеиновых кислот и обеспечивают чистоту мРНК [32].

Анионообменный материал
Анионообменная смола — один из популярных примеров, в котором используется принцип анионного обмена [33]. Он основан на взаимодействии между положительно заряженными группами диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE) на поверхности смолы и отрицательно заряженными фосфатами основной цепи ДНК. Анионообменная смола состоит из определенных гранул диоксида кремния с большим размером пор, гидрофильным поверхностным покрытием и высокой плотностью заряда [34].Большая площадь поверхности смолы позволяет плотно связывать группы DEAE. Смола работает в широком диапазоне условий pH (pH 6–9) и / или концентрации соли (0,1–1,6 M), что может оптимизировать отделение ДНК от РНК и других примесей [34]. Следовательно, концентрация соли и условия pH буферов являются одними из основных факторов, определяющих, связана ли нуклеиновая кислота или элюируется из колонки. ДНК может связываться с группой DEAE в широком диапазоне концентраций соли. Примеси, такие как белок и РНК, отмываются от смолы с использованием буферов со средним содержанием соли, в то время как ДНК остается связанной до тех пор, пока не будет элюирована буфером с высоким содержанием соли [34].
Метод использования анионообменных материалов для выделения нуклеиновой кислоты был раскрыт в изобретении [35], где использовались коммерчески доступные сильные или слабые положительно заряженные анионообменные материалы с выбранными растворами с известной ионной силой для адсорбции и элюирования. Большинство водорастворимых компонентов, таких как белок, можно промыть через колонку, используя раствор с известной ионной силой для связывания нуклеиновых кислот с материалами анионообменной колонки.Ионная сила для элюирования генерируется с использованием известной концентрации соли, которая смешивается с буфером для контроля силы pH, в идеале соответствующей самой низкой ионной силе, при которой нуклеиновые кислоты будут полностью элюироваться [35].

3.2. Тип экстракции белка Метод

Первым этапом очистки белка является лизис клеток. Чтобы эффективно очищать и анализировать белок, они должны быть сначала высвобождены из клетки-хозяина в растворимой форме. Плазматическая мембрана клеток млекопитающих, состоящая из фосфолипидов и белков, легко разрушается [36].Для сравнения, экстракция белка из грибов и бактерий кажется более сложной задачей из-за их стабильной клеточной стенки, которая прочнее плазматической мембраны.

Ткани растений содержат широкий спектр белков, которые различаются по своим свойствам. Некоторые специфические факторы должны быть приняты во внимание при разработке протокола экстракции белка для растений [37]. Например, наличие жесткой клеточной стенки из целлюлозы необходимо разрезать, чтобы высвободить содержимое клетки. Конкретные загрязняющие соединения, такие как фенольные соединения и ряд протеиназ, могут приводить к деградации или модификации белка.Поэтому для экстракции и очистки белка из растений требуются особые условия [38].

Для удаления клеточной стенки используются методы механического разрушения, такие как French Press или стеклянные шарики, с последующей экстракцией общего белка на основе детергента [39].

3.2.1. Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография разделяет белки на основе их поверхностного ионного заряда с использованием смол, которые модифицированы положительно или отрицательно заряженными химическими группами [4, 7].Большинство белков имеют общий отрицательный или положительный заряд в зависимости от их изоэлектрической точки (pI) при заданном pH, что позволяет им взаимодействовать с противоположно заряженной хроматографической матрицей [7]. Если чистый заряд белка положительный при pH ниже значения pI, белок будет связываться с катионитом; при pH выше значения pI чистый заряд белка отрицательный, и белок будет связываться с анионообменником [38].

Белки, которые слабо взаимодействуют со смолами, например, слабый положительно заряженный белок, пропущенный через смолу, модифицированную отрицательно заряженной группой, элюируются в буфере с низким содержанием соли.С другой стороны, белки, которые сильно взаимодействуют, требуют для элюирования большего количества соли. Белки с очень похожими зарядовыми характеристиками могут быть разделены на разные фракции по мере их элюирования из колонки путем увеличения концентрации соли в элюирующем буфере [7].

Ионообменная колонка — одна из технологий, использующих принцип ионообменной хроматографии [33]. Он использует мембранно-абсорбционную технологию в качестве хроматографической матрицы для разделения белков. Мембранные абсорбенты в колоннах изготовлены на основе стабилизированной целлюлозы с высокопористой структурой, которая обеспечивает легкий доступ белков к заряженной поверхности.Взаимодействие между молекулами и активными центрами на мембране происходит в конвективных сквозных порах. Следовательно, адсорбционные мембраны могут поддерживать высокую эффективность при очистке больших биомолекул с низкой диффузией [33].

3.2.2. Гель-фильтрационная хроматография

Гель-фильтрационная хроматография, также называемая эксклюзионной или гель-проникающей хроматографией, разделяет белки в соответствии с размером и формой молекул, при этом молекулы не связываются с хроматографической средой [39].Это процесс, при котором большие молекулы проходят через колонку быстрее, чем маленькие. Маленькие молекулы могут проникать во все крошечные отверстия матрицы и получать доступ к большей части столбца. Белки небольшого размера будут проходить через эти отверстия, и им потребуется больше времени, чтобы вытечь из колонки, по сравнению с белками большого размера, которые не могут попасть в эти отверстия, но выходят прямо из колонки через пустое пространство в колонке [4, 7].

Набор для гель-фильтрационной хроматографии использует принцип гель-фильтрационной хроматографии [40].Целевой образец наносят поверх столбца, который содержит пористые шарики, пример матрицы в столбце. Молекулы разделяются, когда молекулы проходят через столбик пористых шариков. Разделение молекул можно разделить на три основных типа: полное исключение, избирательная проницаемость и общий предел проницаемости. Полное исключение — это та часть, из-за которой большие молекулы не могут проникать в поры и быстро элюироваться. Для области избирательного проникновения промежуточные молекулы могут проникать в поры и могут иметь среднее время пребывания в частицах в зависимости от их размера и формы.Что касается предела общего проникновения, то маленькие молекулы имеют наибольшее время пребывания после того, как они попадают в поры колонки [40]. Преимущество хроматографии на основе гель-фильтрации заключается в том, что она подходит для биомолекул, которые могут быть чувствительны к изменениям pH, концентрации ионов металлов и суровым условиям окружающей среды [39].

3.2.3. Аффинная хроматография

Аффинная хроматография зависит от конкретного взаимодействия между белком и твердой фазой, которое влияет на отделение от примесей.Он состоит из тех же этапов, что и ионообменная хроматография [38]. Он позволяет очищать белок на основе его биологической функции или индивидуальной химической структуры [41]. Белки, которые имеют высокое сродство к определенным химическим группам, таким как лиганды, будут ковалентно присоединяться и связываться с матрицей столбца, в то время как другие белки проходят через столбец [38]. Электростатические или гидрофобные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса и водородные связи — это биологические взаимодействия между лигандами и белками-мишенями [41].Связанные белки будут элюированы из колонки раствором, содержащим высокую концентрацию растворимой формы лиганда [36].

Биоспецифический лиганд, который может ковалентно присоединяться к хроматографической матрице, является одним из требований для успешной аффинной очистки. Связывание между лигандом и молекулами белка-мишени должно быть обратимым, чтобы белки могли быть удалены в активной форме [41]. После смывания загрязнителей связанный лиганд должен сохранять свое специфическое сродство связывания с целевыми белками.Некоторые примеры биологических взаимодействий, которые обычно используются в аффинной хроматографии, перечислены в таблице 1 (см. [41]).