Праймеры — Sileks
Как правильно выбрать праймер
• Если мРНК имеет поли(A) 3′ хвост, то можно использовать праймер oligo-dT для одновременного праймирования всех мРНК.
• Если вы хотите получить кДНК только из подмножества всей мРНК, то можно использовать специфичный для последовательности праймер, который будет связываться только с одной последовательностью мРНК.
• Если вы хотите получить части кДНК, которые были бы разбросаны по всей мРНК, то вы можете использовать случайный коктейль праймеров, который производил бы кДНК из всех мРНК, но эти кДНК не были бы полной длиной.
Основными преимуществами случайного праймирования являются получение более коротких фрагментов кДНК и повышение вероятности того, что 5′-концы мРНК будут преобразованы в кДНК.
Поскольку обратная транскриптаза обычно не достигает 5′-конца длинной мРНК, случайные праймеры могут иметь в этом случае преимущество.
Специфические праймеры
Специфические праймеры, гомологичные конкретной последовательности, обладают наибольшей специфичностью и являются наиболее подходящими из вариантов праймеров для обратной транскрипции. Однако они не обеспечивают гибкости олиго (dT) и случайных праймеров, а это означает, что необходимо проводить отдельную реакцию синтеза кДНК для каждого исследуемого гена. Это делает специфические праймеры менее оптимальными для обработки ограниченных образцов тканей или клеток.
В одностадийных реакциях ОТ-ПЦР всегда используется ген-специфический праймер для синтеза первой цепи кДНК, в то время как двухэтапная ОТ-ПЦР позволяет использовать различные варианты праймеров.
Праймеры Oligo (dT)
Праймеры Oligo (dT) являются предпочтительным выбором для двухэтапных реакций синтеза кДНК из-за их специфичности в отношении мРНК и потому, что они позволяют изучать множество различных мишеней из одного пула кДНК. Однако, поскольку они всегда инициируют обратную транскрипцию на 3´ конце транскрипта, сложная вторичная структура может привести к неполному синтезу кДНК.
Олиго (dT)20 представляет собой гомогенную смесь 20-мерных тимидинов, а олиго (dT)12–18 представляет собой смесь 12-мерных и 18-мерных тимидинов. Также, заякоренные олиго (dT) праймеры предназначены для предотвращения проскальзывания поли(А), обеспечивая их отжиг на стыке 3´UTR / полиА. Пример заякоренного олиго (dT)20
Выбор лучшего олиго (dT) праймера может частично зависеть от температуры обратной транскрипции. Более термостабильные обратные транскиптазы могут работать лучше с более длинными праймерами, которые остаются более плотно отожженными при повышенных температурах по сравнению с их более короткими аналогами.
Праймеры олиго (dT) не рекомендуются в качестве единственного праймера для синтеза кДНК, если для нормализации в эксперименте ПЦР в реальном времени используется 18S рРНК, поскольку праймер олиго (dТ) не отжигается.
Случайные праймеры
Случайные праймеры отлично подходят для синтеза больших пулов кДНК. Они также идеально подходят для неполиаденилированной РНК, такой как бактериальная РНК, потому что они отжигаются по всей молекуле-мишени.
Использование комбинации случайных и олиго (dT) праймеров может иногда повысить качество данных за счет объединения преимуществ обоих, если они используются в одной и той же реакции синтеза кДНК первой цепи.
Следует помнить, что случайные праймеры используются только в двухэтапных реакциях ОТ-ПЦР.
Мастики и праймеры
Праймер
— Праймер битумно-полимерный ТЕХНОНИКОЛЬ №03
Мастика кровельная и гидроизоляционная
— Мастика кровельная ТЕХНОНИКОЛЬ №21 (Техномаст)
— Мастика для гибкой черепицы ТЕХНОНИКОЛЬ № 23 (Фиксер)
— Кровельная мастика горячая ТЕХНОНИКОЛЬ №41 (Эврика)
— Мастика гидроизоляционная ТЕХНОНИКОЛЬ №24 (МГТН)
— Мастика водоэмульсионная ТЕХНОНИКОЛЬ №33
— Герметик бутилкаучуковый ТехноНИКОЛЬ №45
— Мастика приклеивающая ТЕХНОНИКОЛЬ №27
— Мастика защитная алюминиевая ТЕХНОНИКОЛЬ № 57
— Клей Bitumast для экструзионного пенополистирола
— Клей КРЕПС для газобетона
Однокомпонентная мастика (на растворителях) — это мастика, которая поставляется в готовом для применения виде, и отвердение ее состава происходит при улетучивании растворителя, чему препятствует герметичная тара. Поэтому срок ее хранения редко превышает три месяца. Исключение составляет полиуретановая мастика, отвердение которой происходит под действием паров воды, всегда содержащихся в воздухе. В отсутствие растворителя, полиуретановая мастика отверждается (полимеризуется) без усадки. Срок хранения такой мастики в герметичной таре 12 месяцев.
Двухкомпонентная мастикаЭксплуатационное качество мастичной кровли в значительной мере зависит от правильного выполнения работ по приготовлению мастики непосредственно на строительной площадке и нанесения ее на основание. Однокомпонентная мастика имеет некоторое преимущество, так как готовый к применению состав сразу наноситься на поверхность. При использовании двукомпонентной мастики необходимо вначале приготовить смесь, а лишь затем нанести ее на поверхность. Это существенно повышает требования к соблюдению технологии работ. С другой стороны приготовление двукомпонентной мастики на строительной площадке позволяет изменить ее свойства в соответствии с реальными требованиями. Для изменения отдельных свойств мастики (вязкость, цвет, твердость и др.) в нее, при приготовлении, вводятся специальные добавки. При использовании же однокомпонентной мастики для изменения ее свойств приходится менять марку или тип мастики, что менее удобно.
Битумно-полимерные и полимерные мастики можно наносить на различные поверхности (стальную, бетонную, рубероидную) любой, даже самой сложной конфигурации (уклоны крыш, на которые укладывают мастики, не ограничены, вплоть до куполов и шпилей). Но существует одно важное условие: поверхность должна быть идеально ровной, иначе будет невозможно добиться одинаковой толщины мастичного покрова. Это самый большой недостаток мастик.
Мастику наносят на основание в жидком виде. После испарения растворителя, она твердеет, образуя сплошную бесшовную гидроизоляционную пленку. Толщина образовавшейся пленки зависит от количества сухого остатка в мастике. У мастик, в состав которых не входит растворитель, отвердение происходит без уменьшения толщины нанесенного состава.
Необходимо обращать внимание на то, что при уклонах кровель более 12% и температуре наружного воздуха выше 25°С в мастику необходимо вводить специальные наполнители, повышающие ее вязкость (загустители, цемент и др.).
Современные типы мастик не нуждаются в защитном слое, так как окрашенные в массе они обладают необходимыми декоративными свойствами, а сам материал достаточно стоек к атмосферным воздействиям.
При необходимости защиты кровли от механических воздействий (места проходов, установки инженерного оборудования и т.п.) выполняется защитный слой из мелкого гравия (10-20 мм), крупного песка (2-5 мм), мелкоразмерных асбестоцементных или битумных листов и т.д. Идеальным защитным слоем является речная галька.
Для улучшения прочностных характеристик мастичных кровель их можно армировать стеклохолстом или стеклосеткой. Стеклосетка — это тканная сетка из очень прочных стеклонитей. Стеклосетки различаются по толщине нитей и размеру ячеек. Стеклохолст — это полотнище из произвольно расположенных стекловолокон. Оба материала характеризуются большой механической прочностью, поэтому их и принято использовать в качестве армирующих прокладок. Армирование повышает прочность, но снижает эластичность мастичного покрытия, поэтому необходимо уяснить, что для данной кровли предпочтительнее. Армирование можно выполнять лишь в отдельных узлах (обычно примыканиях и сопряжениях). Обычные стеклосетки и стеклохолсты характеризуются слабой адгезией к битуму, поэтому для армирования следует применять материалы со специальной пропиткой.
Области применения мастики и праймера
- Гидроизоляция межпанельных швов, примыканий кровли к вертикальным стенам
- Устройство и ремонт кровель
- Гидроизоляция подвалов, бассейнов, лоджий, санузлов и прочих помещений с наружной и внутренней стороны
- Защита железобетонных, металлических и деревянных строительных конструкций, сооружений и инженерных коммуникаций
- Сантехнические работы
- Антикоррозийная и изоляционная защита металлических поверхностей и конструкций
Diversity of PCR primers and principles of their design / Разнообразие праймеров для ПЦР и принципы их подбора
Разнообразие праймеров для ПЦР
[Gilham, Khorana, 1958], разработанного под
руководством другого Нобелевского лауреата по
физиологии и медицине 1968 г. Х.Г.Кораны. Так,
фосфодиэфирный метод синтеза надолго стал
основным методом, с помощью которого велся синтез
олигонуклеотидов, и оставался таковым до начала 70-
х гг. прошлого столетия. При этом одним из главных
его недостатков была крайне низкая скорость
конденсации, из-за чего на синтез олигонуклеотида
длиной 12 звеньев уходило почти три месяца.
Причем, такой синтез был под силу только
высококлассным химикам.
В середине 60-х гг. внимание исследователей
оказалось вновь обращено на фосфотриэфирный
метод, после того как был предложен его
твердофазный вариант [Letsinger, Mahadevan, 1966] и
разработан ряд прочих вариаций этого способа
[Eckstein, Rizk, 1967; Reese, Saffhill, 1968]. В середине
1970-х гг. было обнаружено, что трехвалентный
фосфор гораздо реакционноспособнее, нежели
пятивалентный, что привело к разработке нового
метода синтеза олигонуклеотидов, названного
фосфиттриэфирным [Letsinger et al., 1975; Letsinger,
Lunsford, 1976] и получившего дальнейшее развитие,
в том числе в твердофазном варианте [Matteucci,
Caruthers, 1981], что явилось важным шагом к
автоматизации всего процесса. Наибольшего прорыва
удалось добиться, когда был разработан вариант
фосфиттриэфирного метода синтеза
олигонуклеотидов, названный амидофосфитным
[Becauge, Caruthers, 1981]. Его особенно серьезное
преимущество выявилось после того как стал в
качестве активатора использоваться 1H-тетразол
[McBride, Caruthers, 1983]. Целый ряд дальнейших
улучшений амидофосфитного метода привел к тому,
что в настоящее время он стал основным методом
синтеза олигонуклеотидов.
Автоматический синтез олигонуклеотидов
сейчас осуществляется с помощью специальных
приборов – ДНК синтезаторов, появление которых
пришлось на первую половину 1980-х гг. [Alvarado-
Urbina et al., 1981; Hunkapillar et al., 1984; Caruthers,
1985]. Синтез ведется на специальных носителях,
представляющих собой твердую фазу, которой
обычно служит стекло с определенными размерами
пор либо слабонабухающие макропористые
полистирольные шарики. К таким носителям, как
правило, ковалентно присоединен тот или иной 3’-
концевой нуклеотид. В амидофосфитном методе для
синтеза используются амидофосфиты, являющиеся
фактически обычными азотистыми основаниями, в
которых все реакционноспособные группы (амино-,
гидроксильные, фосфатные) защищены
соответствующими блокаторами нежелательных
реакций, большинство которых удаляются по
завершению всего синтеза, тогда как 4,4’-
диметокситритильная группа, защищающая
гидроксил в 5’-положении, удаляется в начале
каждого цикла, поскольку именно к данному месту
присоединяется очередное звено. Могут
использоваться и другие амидофосфиты, служащие, в
том числе, для введения различных реакционных
групп, используемых обычно пост-синтетически для
мечения олигонуклеотидов флуоресцентными
красителями, биотином, прочими модификациями.
Сейчас на синтез, например, 25-звенного
олигонуклеотида с активацией тетразолом или его
аналогами уходит всего около трех часов в отличие
от многих месяцев, требовавшихся на такой синтез
фосфодиэфирным методом, не говоря уже о крайне
низком прежде выходе конечного олигонуклеотида.
Олигонуклеотидный синтез заключается в
циклическом повторении реакций депротекции
(удаление тритильной защиты), конденсации,
кэпирования, окисления, что осуществляется путем
пошагового добавления соответствующих реагентов.
Следует отдельно остановиться на стадии
кэпирования, в ходе которой происходит выведение
из дальнейшего процесса синтеза
непрореагировавшей во время конденсации части 5’-
гидроксильных групп (0,1 — 1%), что предотвращает
образование неправильных продуктов с
отсутствующими нуклеотидными остатками внутри
цепи. По завершению синтеза производится снятие
всех защитных групп и самого нуклеотида с
твердофазного носителя, что приводит к появлению
функциональной одноцепочечной ДНК с
гидроксильными группами на 3’- и 5’-концах (в
случае синтеза обычного немодифицированного
олигонуклеотида), но в растворе остаются
органические загрязнения из защитных групп, в связи
с чем готовый олигонуклеотид необходимо
обессолить. Дальнейшая очистка синтезированного
олигонуклеотида с помощью электрофореза в
полиакриламидном геле или высокоэффективной
жидкостной хроматографии зависит от его состава
(модификаций) и стоящих задач. При эффективности
олигонуклеотидного синтеза амидофосфитным
методом, превышающей обычно 99%, выход
целевого продукта в виде 25-звенного
олигонуклеотида составляет около 90% и из них
менее 1% может быть представлено
олигонуклеотидом из 24 звеньев (N-1), причем
недоставать будет только концевого малозначимого
нуклеотида на 5’-конце.
Синтез олигонуклеотидов обычно ведется в
направлении 3’→5’ и это важно знать для того, чтобы
понимать, что самый критичный 3’-нуклеотид в
праймере (о чем подробно будет говориться ниже)
является первым при синтезе и часто «пришит» к
Addgene: Protocol — How to Design Primers
Primer Design for PCR
Олигонуклеотидные праймеры необходимы при проведении реакции ПЦР. Необходимо разработать праймеры, комплементарные матричной области ДНК. Они синтезируются химическим путем путем соединения нуклеотидов. При добавлении нуклеотида по одному необходимо избирательно блокировать и многократно разблокировать реактивные группы на нуклеотиде. Основное свойство праймеров состоит в том, что они должны соответствовать последовательностям на матричной молекуле (должны быть комплементарными матричной цепи).Однако необязательно, чтобы праймеры полностью соответствовали цепи матрицы; однако важно, чтобы 3 ’конец праймера полностью соответствовал цепи матричной ДНК, чтобы можно было продолжить удлинение. Обычно гуанин или цитозин используют на 3 ’конце, а 5’ конец праймера обычно имеет участки в несколько нуклеотидов. Кроме того, оба 3 ’конца гибридизированных праймеров должны указывать друг на друга.
Размер грунтовки также очень важен. Короткие праймеры в основном используются для амплификации небольшого простого фрагмента ДНК.С другой стороны, длинный праймер используется для амплификации образца геномной ДНК эукариот. Однако праймер не должен быть слишком длинным (> 30-членные праймеры) или слишком коротким. Короткие праймеры производят неточный, неспецифический продукт амплификации ДНК, а длинные праймеры приводят к более медленной скорости гибридизации. В среднем фрагмент ДНК, который необходимо амплифицировать, должен иметь размер в пределах 1–10 кБ.
Структура грунтовки должна быть относительно простой и не содержать внутренней вторичной структуры, чтобы избежать внутреннего складывания.Также необходимо избегать отжига праймер-праймер, который создает димеры праймеров и нарушает процесс амплификации. При разработке, если не уверены в том, какой нуклеотид поместить в определенное положение внутри праймера, можно включить более одного нуклеотида в это положение, называемое смешанным сайтом. Можно также использовать молекулярную вставку на основе нуклеотидов (инозин) вместо обычного нуклеотида для более широких возможностей спаривания.
С учетом вышеизложенной информации грунтовки обычно должны иметь следующие свойства:
- Длина 18-24 баз.
- 40-60% содержание G / C
- Начало и конец с 1-2 парами G / C
- Температура плавления (Тпл) 50-60 ° С
- Пары праймеров должны иметь Tm в пределах 5 ° C друг от друга.
Пары праймеров не должны иметь дополнительных участков
Примечание: Если вы будете включать сайт рестрикции на 5 ’конце вашего праймера, обратите внимание, что« зажим »из 3-6 пар оснований должен быть добавлен выше, чтобы фермент эффективно расщеплялся (например,г. GCGGCG-сайт рестрикции-ваша последовательность).
DNA Primer — обзор
Олигонуклеотидные праймеры
Олигонуклеотидные праймеры обычно используются в реакциях ПЦР в концентрации 1 мкмоль -1 (50 пмоль на 50 мкл реакции). Могут использоваться концентрации от 0,1 до 1 мкмоль л -1 . Более высокие концентрации могут увеличить неспецифический отжиг праймеров и, следовательно, неспецифические продукты амплификации.Праймеры для ПЦР обычно имеют длину от 18 до 30 нуклеотидов и предпочтительно должны иметь содержание гуанин + цитозин (G + C) около 50%. Температура, при которой половина молекул ДНК будет двухцепочечной, T m , в градусах Цельсия для праймера, оценивается по уравнению большого пальца: 2 × (количество As и Ts) +4 × количество G и C) (A = аденин, T = тимин). Однако более точный расчет олигонуклеотида T m требует учета эффектов ионной силы и соседних оснований в цепи ДНК (методы расчета ближайшего соседа T m ).Для выполнения этих расчетов доступно программное обеспечение. Значения T m для двух праймеров в реакции должны быть аналогичными, а используемая температура отжига обычно на ~ 5 ° C ниже T m . Когда температура отжига приближается к T m , достигаются более конкретные усиления, но общий выход может снизиться. Несмотря на тщательные расчеты, эмпирическое тестирование температур отжига важно для хорошо оптимизированного анализа ПЦР.Следует избегать комплементарности на 3′-концах пар праймеров, поскольку это способствует образованию олигомеров праймеров (димеров праймеров). Такие искусственные продукты сами по себе являются матрицами для амплификации ПЦР и конкурируют с желаемыми продуктами за дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), полимеразу и праймеры. Это приводит к снижению выхода желаемого продукта и наличию неспецифических продуктов, которые могут усложнить анализ.
Праймер-олигомер образуется, когда два или более праймера отжигаются друг с другом и удлиняются во время ПЦР.Двухцепочечный продукт действует как матрица во время последующих раундов амплификации и конкурирует с желаемым продуктом. Как правило, низкие температуры отжига, высокие концентрации ферментов и высокие концентрации праймеров увеличивают вероятность олигомеризации праймера. Однако именно строгость во время начального цикла ПЦР наиболее важна для образования праймерного олигомера, а также для неспецифических продуктов ПЦР в целом. Были описаны различные методы поддержания высокой строгости до момента, когда праймеры и фермент смешиваются вместе (обычно называемые горячим стартом).Методы горячего старта включают смешивание фермента и праймеров только после того, как реакция достигнет строгой температуры. Простой метод горячего старта — это ручное добавление небольшого объема (обычно 5–10 мкл) реакционного буфера, содержащего фермент, к другим компонентам, поддерживаемым в термоциклере при ∼80 ° C, с последующим продолжением стандартной амплификации ПЦР. Другой метод включает герметизацию части реакции амплификации под воском с последующим добавлением оставшихся реагентов выше парафинового барьера.Ферментативные методы для достижения той же цели включают использование модифицированной ДНК-полимеразы, которая блокируется термолабильной группой, или использование урацил-ДНК-гликозилазы (урацил- N -гликозилаза, UNG), дезоксиуридинтрифосфата (dUTP) и краткого описания. начальная инкубация при 50 ° C. Обычно дУТФ заменяют на эквимолярной основе дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) (200 мкмоль л -1 ), но более высокие концентрации дУТФ (125–300 мкмоль л -1 ) могут быть полезными в некоторых анализах.Урацил-ДНК-гликозилаза используется в количестве 1-2 единиц на реакцию. Этот метод гарантирует, что любой неспецифический продукт или олигомер праймера, который образуется в начальных условиях низкой жесткости, будет содержать урацил (U) и, следовательно, будет подвержен расщеплению UNG. Урацил иссекается во время инкубации при 50 ° C, и на этих базовых участках во время начальной стадии денатурации происходит разрыв цепи. Помимо инактивации любых контаминирующих ампликонов, этот метод снижает количество неспецифических продуктов и праймерного олигомера.Поскольку остаточный UNG может разрушить U-содержащие ампликоны, продукты ПЦР необходимо анализировать немедленно или хранить при 4 ° C в течение коротких периодов времени или замораживать в течение длительного времени. В качестве альтернативы UNG можно удалить экстракцией органическими растворителями или расщепить протеазами.
3′-конец праймера для ПЦР должен быть полностью комплементарен матричной ДНК. Неспособность 3′-конца гибридизоваться приводит к неэффективной амплификации. Внутренние последовательности менее важны. При условии использования подходящей температуры отжига можно использовать вырожденные праймеры (праймеры, которые состоят из пула различных, но близкородственных олигонуклеотидов), чтобы гарантировать, что праймеры будут отжигаться с сильно вариабельными последовательностями или последовательностями, которые известны лишь частично.Эти праймеры созданы на основе аминокислотных последовательностей или на основе сравнения аналогичных генов других организмов. Последовательности на 5′-конце праймера наименее важны. Если гибридизующаяся часть праймера будет достаточно длинной для обеспечения отжига с ДНК-матрицей, негомологичные 5′-удлинения (области, которые не соответствуют последовательности матрицы) могут быть использованы для введения сайтов рестрикционных ферментов в продукты ПЦР, подлежащие клонированию, или для добавления других последовательностей, таких как промоторы фаговой РНК-полимеразы.
Мультиплексная ПЦР позволяет обнаруживать несколько последовательностей генов в одной реакции. Поскольку несколько наборов праймеров для ПЦР должны функционировать в одной и той же реакции без помех, дизайн праймера и оптимизация условий реакции имеют решающее значение.
Праймеры часто помечают детектируемыми группами для облегчения анализа после ПЦР. Наиболее широко используются радиоактивные изотопы, гаптены, такие как биотин, или флуоресцентные красители. Метки, прикрепленные к 5′-концу праймера, практически не влияют на амплификацию.
Многие термостойкие полимеразы, используемые для ПЦР, проявляют независимую от матрицы активность, которая добавляет дезоксинуклеозиды (преимущественно дезоксиаденозин) к 3′-концам всех двухцепочечных молекул в реакции. Эти выступы A должны быть заполнены до клонирования продуктов ПЦР с тупым концом. Альтернативно доступны специальные векторы, которые имеют одиночные 3′-выступы на сайте клонирования, готовые для вставки продукта ПЦР. Выбор полимеразы без этой активности или корректировка условий реакции для минимизации или максимизации степени A-выступов может привести к более резким пикам при электрофоретическом анализе с высоким разрешением.
Праймеры ДНК — обзор
6.13.2 Исследования генетического разнообразия и структуры популяции
Ruas et al. (1999) использовали 33 праймера RAPD для изучения генетического родства между 19 образцами, включая 6 видов рода Chenopodium . Образцы C. quinoa , C. nuttalliae и C. pallidicaule показали низкую внутривидовую изменчивость.
Родригес и Исла (2009) использовали маркеры AFLP вместе с морфологическими маркерами для изучения полиморфизма и генетической взаимосвязи у 20 образцов квиноа.Fuentes et al. (2009) охарактеризовали 59 чилийских образцов квиноа с использованием 20 маркеров SSR, генерирующих 150 аллелей со средним значением 7,5 аллеля / локуса. Были выделены две отдельные группы, одна с севера (высокогорье Анд), а другая с юга (низменность или прибрежная зона).
Rana et al. (2010) охарактеризовали 55 образцов, принадлежащих к 14 видам Chenopodium , включая киноа, с использованием 12 маркеров RAPD и DAMD, сгенерировали 242 маркера и показали, что комплекс C. album является гетерогенным и требует переоценки.
Коста-Тартара и др. (2012) охарактеризовали 35 образцов квиноа из Аргентины, используя 22 маркера SSR. В общей сложности было создано 354 аллеля, в среднем по 16 аллелей на локус, и отмечен высокий уровень генетического разнообразия. Fuentes et al. (2012) также охарактеризовали 34 образца квиноа из Эквадора, Колумбии, Перу, Боливии, Чили и Аргентины с использованием 20 маркеров SSR и выявили широкое генетическое разнообразие.
Maughan et al. (2012) идентифицировали 14 178 предполагаемых SNP с использованием протокола сокращения генома и разработали 511 функциональных анализов SNP на основе химии генотипирования KASPar.Исследования разнообразия на панели из 113 образцов квиноа показали, что средняя частота минорных аллелей SNP составила 0,28. Структурный анализ разделил кластер на 2 основные подгруппы, соответствующие андскому и прибрежному экотипам квиноа. Карта сцепления, состоящая из 29 групп сцепления, покрывающих 1404 сМ с плотностью маркера 3,1 см на маркер SNP, была создана с использованием двух популяций RIL.
Christensen et al. (2007) охарактеризовали 121 образец квиноа из Эквадора, Перу, Боливии, Чили и Аргентины с использованием 36 маркеров SSR и сгенерировали 420 аллелей, в среднем по 11 аллелей на локус.Del Castillo et al. (2007) сообщили о характеристике 87 образцов боливийской квиноа с использованием маркеров RAPD, сильной популяционной структуре и высокой внутрипопуляционной изменчивости.
Zhang et al. (2017b) охарактеризовали SNP и вариации InDel в геноме квиноа с помощью повторного секвенирования de novo 11 образцов квиноа, а 85 диморфных маркеров InDel были разработаны и проверены с использованием 129 образцов квиноа в сочетании с 62 маркерами SSR. Молекулярный групповой анализ классифицировал эти образцы на две основные группы, относящиеся к Андским высокогорным регионам и прибрежным чилийским регионам соответственно.
Саад-Аллах и Юсеф (2018) сообщили о генетической оценке наряду с фитохимическими исследованиями зародышевой плазмы киноа, завезенной в Египет, с использованием 4 маркеров RAPD и 7 маркеров ISSR. Результаты генетического анализа подтвердили, что маркеры RAPD и ISSR могут использоваться для эффективного различения генотипов квиноа.
В другом тематическом исследовании генотипирование квиноа с помощью молекулярного маркера помогло отследить изменения и преемственность в разнообразии квиноа на протяжении 18 веков. В общей сложности 157 древних и современных образцов квиноа были генотипированы с использованием 24 маркеров SSR, и анализ слияния показал, что генетический дрейф в пределах одной популяции не может объяснить генетическую дифференциацию между древними и современными квиноа (Winkel et al., 2018). Romero et al. (2019) сгруппировали 26 разновидностей киноа в 5 групп на основе молекулярного анализа девяти SSR-локусов.
Школа биомедицинских наук Wiki
Из Вики Школы биомедицинских наук
Праймер представляет собой специально разработанную последовательность оснований длиной приблизительно 18-20 п.н. Праймеры позволяют ДНК-полимеразе начать удлинение ДНК. Праймеры используются в полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве стадии амплификации короткой последовательности ДНК.Они уникальны тем, что связываются только с определенной областью ДНК, где транскрипция ДНК начинается от 5 ‘до 3’. Поскольку праймеры широко используются в полимеразной цепной реакции (ПЦР), эта характеристика праймеров имеет преимущество в предотвращении загрязнения различными ДНК из других источников, и можно амплифицировать конкретную область желаемой ДНК.
Праймер — это короткая цепочка нуклеотидов, используемых в синтезе ДНК. Праймеры необходимы для функционирования ДНК-полимеразы, поскольку фермент может строить нуклеотиды только на существующей цепи ДНК.Они синтезируются ферментом под названием примаза и комплементарны по основанию одноцепочечной ДНК-матрице с 3′-концом ОН [1] . Праймеры представляют собой короткие молекулы РНК в живых клетках, однако ДНК служит праймером в неживых клетках ( in vitro, ), например, в ПЦР [2] . ДНК-полимераза I играет важную роль в процессе репликации путем удаления праймера РНК во время его активности корректирующего считывания [3] . Процедура ПЦР требует 3 различных температур для выполнения 3 важных шагов.во-первых, цепи ДНК должны быть денатурированы для образования одиночных цепей при 94 ° C, во-вторых, охлажденная однониточная ДНК отжигается с праймерами при 55 ° C и, наконец, синтез и удлинение вновь образованных цепей ДНК с использованием полимеразы TAQ при 74 ° C. . У разных праймеров температура отжига немного различается. Сила шприца и специфичность повторной ПЦР зависит от используемого праймера и концентрации Mg2 + для отображения точной температуры отжига, что позволяет сформировать правильный продукт ПЦР.
Дизайн грунтовки
Праймерысоставляют от 18 до 30 оснований в зависимости от генома. Чем длиннее геном, который вы собираетесь клонировать, тем длиннее праймер. Чем длиннее грунтовка, тем больше несоответствий она может выдержать. Температура плавления должна быть около 60-65 ° C, так как это температура отжига праймеров в ПЦР. Это зависит от используемых нуклеотидных оснований и длины праймера и может быть рассчитано по следующему уравнению:
T m = (4xG / C) + (2xA / T)
G или Cs на 3′-конце грунтовки необходимы, поскольку они являются стабильными основаниями и не склонны к несоответствию так легко, как T и А.Следует избегать вторичных структур в праймере и ДНК-мишени, таких как петли ствола или выпуклости, поскольку они будут плохо праймировать последовательность DMA-мишени.
Также важно избегать гибридизации праймеров, так как это может вызвать самоамплификацию праймеров. Это называется праймер-димером.
Вычислительные подходы теперь используются для оптимального дизайна праймеров.
Список литературы
- ↑ Berg, J. et al. , (2007), Биохимия, 7-е издание, Нью-Йорк, WH Freeman.Стр. 852
- ↑ Хартл Д. и Джонс В., (2009), Генетика; Анализ генов и геномов, 7-е издание, издатели Садбери, Джонса и Бартлетта. Стр.56
- ↑ Berg, J. et al. , (2007), Биохимия, 7-е издание, Нью-Йорк, WH Freeman. Стр. 864
праймеров ДНК для синтеза — Биология LibreTexts
Создание праймеров для синтеза ДНК
Фермент primase катализирует синтез праймеров, из которых ДНК-полимеразы могут начать синтез (Рисунок 5.21). Праймеры представляют собой короткие олигонуклеотиды длиной от 6 до 60 нуклеотидов. Они могут состоять из рибонуклеотидов или смеси дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов. Основной примазой в E. coli является белок 60 кДа, называемый белком DnaG , продуктом гена dnaG . Основная примаза в эукариотических клетках — это ДНК-полимераза \ (\ alpha \) .
Примаза E. coli , белок DnaG, не может синтезировать праймеры сама по себе, а скорее является частью гораздо более крупного комплекса, называемого примосомой .Примосома действует многократно во время синтеза отстающей цепи, обнаруживая сайт связывания праймера на одноцепочечной матричной цепи, покрытой SSB, и синтезируя праймер. Идентификации компонентов примосомы способствовала удобная модельная система в vitro синтез ДНК fX174. fX174 — одноцепочечный бактериофаг; ДНК, обнаруженная в вирусе, называется положительной цепью. После заражения E. coli эта плюс-цепь превращается в двухцепочечную репликативную форму (рис.24 А). Превращение одноцепочечной ДНК фага в дуплексную ДНК происходит путем синтеза нескольких фрагментов Окадзаки, и, следовательно, это хорошая модель для прерывистого синтеза на отстающей цепи. Эта реакция может быть осуществлена in vitro, , что позволило биохимически разделить различные стадии сборки и движения примосомы.
| белок | ген | виды деятельности и функции |
|---|---|---|
| PriA | priA | геликаза, перемещение от 3 ‘до 5’, распознавание местоположения |
| ПриБ | priB | |
| PriC | ПРИЦ | |
| ДнаТ | ДНК | необходимо для добавления комплекса DnaB ‑ DnaC к препримосоме |
| DnaC | ДНК | образует комплекс с ДНАБ |
| ДНАБ | ДНК | геликаза, движение 5 ‘на 3’.ДНК-зависимая АТФаза. |
| ДНК | ДНК | синтезировать праймер |
Пять различных белков обнаружены в прерайминговом комплексе , PriA, PriB, PriC, DnaT и DnaB (таблица 5.4). Шестой белок, DnaC, необходим для сборки этого комплекса. В случае матрицы вирусной ДНК fX174, покрытой SSB, PriA (рис. 5.24 B) распознает сайт сборки праймера. Затем добавляются белки PriB и PriC с образованием комплекса.Гексамерный белок DnaB находится в комплексе с шестью молекулами DnaC , когда его нет в ДНК. В процессе, зависящем от ATP, и с помощью DnaT , DnaB переносится в шаблон, и DnaC выпускается.
Предварительный затравочный комплекс теперь готов для примазы , DnaG , для связывания и создания активной примосомы. Хотя роль каждого из белков в примосоме еще не ясна, имеется информация о некоторых этапах действия примосомы.Предпочтительным сайтом связывания на матрице для примазы является CTG, при этом T используется в качестве матрицы для первого нуклеотида праймеров. Комплекс с высоким сродством между DnaB и АТФ формирует или стабилизирует вторичную структуру в одноцепочечной матричной ДНК, которая используется примазой; Полагают, что именно так DnaB «активирует» примазу, чтобы начать синтез. После гидролиза АТФ DnaB комплекс с низким сродством ADP-DnaB диссоциирует от матрицы. Примосома теперь может перейти к следующему сайту для синтеза праймера.
Рисунок 5.24. Сборка и миграция примосомы. После сборки комплекса предпрайминга, DnaG присоединяется к комплексу для завершения примосомы. После синтеза праймера (темно-черная линия) примосома переходит к следующему сайту для синтеза. Это отслеживание вдоль одноцепочечной ДНК, покрытой SSB, требует гидролиза АТФ и вызывает диссоциацию некоторых SSB. На диаграмме показана примосома, движущаяся в направлении от 5 ‘до 3’ вдоль цепи матрицы (по часовой стрелке), что противоположно направлению синтеза праймера.Это было бы направление движения, катализируемое DnaB. Примосома также содержит PriA, который катализирует движение по одноцепочечной ДНК в противоположном направлении. После того, как праймеры были синтезированы, ДНК-полимераза III может синтезировать из них фрагменты Окадзаки, праймеры вырезаются и зазоры восстанавливаются с помощью ДНК-полимеразы I, а затем фрагменты лигируются.Примосома содержит две геликазы, которые могут перемещаться по одноцепочечной ДНК с противоположной полярностью. PriA движется в направлении от 3 футов до 5 футов, тогда как DnaB движется в направлении от 5 футов до 3 футов.При тестировании в vitro с субстратом, аналогичным показанному на рис. 5.22, фрагменты с каждого конца смещаются, что указывает на то, что примосома перемещалась в одном направлении на одних молекулах и в другом направлении на других. На рис. 5.24B показана миграция, вызванная геликазой DnaB, но движение также может происходить и в другом направлении.
Праймеры и условия для ПЦР
Опубликованные праймеры для ПЦР для амплификации STR-локусов
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на связывании характеристики олигонуклеотидных праймеров, используемых для определения целевая область ДНК.Часто требуется много усилий разработать праймеры, которые специфически связываются с областью представляющих интерес и которые не образуют димеры праймеров (т. е. связываются с самих себя). Поскольку положения праймеров определяют размер Для продуктов ПЦР праймеры иногда модифицируют при получении мультиплексов STR. Другой группы часто конструировали уникальные праймеры для одних и тех же STR-локусов. Информационные бюллетени STR учитывают это учет, перечислив каждый набор праймеров с последующей ПЦР размеры изделия.Здесь мы разделили опубликованные праймеры для ПЦР. на две группы.
Британская служба судебной медицины Грунтовка
Caskey / Promega / Прочие грунтовки
Коммерческий набор последовательностей праймеров
Комплекты Promega PowerPlex 1.1 и 1.2, Комплект PowerPlex 16
Прикладные биосистемы считает свои последовательности праймеров собственностью и не публиковала их
ВЕРНУТЬСЯ НА ГЛАВНУЮ
Пожалуйста, присылайте комментарии или предложения по этой базе данных команде STRBase по адресу strbase @ nist.губ.
Заявление об ограничении ответственности
Мы приложили и будем продолжать прилагать большие усилия для обеспечения точности и полноты данных, включенных в эту базу данных STR. Информация будет добавляться время от времени, чтобы поддерживать этот сайт в актуальном состоянии. Национальный институт стандартов и технологий (NIST) никоим образом не несет ответственности за информацию, предоставляемую через этот сайт, включая гиперссылки на коммерческие источники материалов. Некоторые коммерческие поставщики указаны на этом веб-сайте, чтобы принести пользу сообществу специалистов по типированию ДНК.Ни в коем случае такая идентификация не подразумевает рекомендацию или одобрение NIST и не подразумевает, что идентифицированный материал, инструмент или оборудование обязательно являются лучшими из имеющихся для тестирования личности человека.
Все пользователи соглашаются с тем, что любой доступ и использование этого веб-сайта и любых сайтов, связанных с этим сайтом, и их содержание осуществляется на их страх и риск. Ни NIST, ни веб-мастер интернет-базы данных STR DNA не несут ответственности за содержание страниц за пределами этого веб-сайта.
Наш веб-сайт содержит ссылки на различные другие федеральные агентства и частные организации. После перехода по ссылке на другой сайт вы подпадаете под действие политики конфиденциальности нового сайта. Всегда полезно читать Политику конфиденциальности любого сайта, который вы посещаете. Заявление о конфиденциальности NIST см. В разделе.
PrimerBank
| Поиск праймеров для ПЦР
Здесь вы можете применить свою последовательность к базе данных банка праймеров. | Заказать Oligos Вы можете синтезировать праймеры и секвенировать продукты ПЦР по адресу: |
PrimerBank — это общедоступный ресурс для праймеров для ПЦР.Эти праймеры предназначены для обнаружения или количественной оценки экспрессии генов (ПЦР в реальном времени). PrimerBank содержит более 306 800 праймеров, охватывающих большинство известных генов человека и мыши. Существует несколько способов поиска праймеров: доступ в GenBank, доступ к белку NCBI, идентификатор гена NCBI, символ гена Новинка! , PrimerBank ID или Keyword (описание гена), или вы можете взломать последовательность своего гена против базы данных последовательности праймеров Новинка! .
Алгоритм конструирования праймеров был тщательно протестирован экспериментами ПЦР в реальном времени на предмет специфичности и эффективности ПЦР.Мы протестировали 26 855 пар праймеров, которые соответствуют 27 681 гену мыши, с помощью ПЦР в реальном времени с последующим электрофорезом в агарозном геле и секвенированием продуктов ПЦР. Процент успеха дизайна составляет 82,6% (22 187 успешных пар праймеров) на основе электрофореза в агарозном геле.
Все данные экспериментальной проверки праймеров для мышей доступны в PrimerBank. Для просмотра перейдите по соответствующим ссылкам на странице информации для начинающих.
Публикация:
Xiaowei Wang, Athanasia Spandidos, Huajun Wang и Brian Seed: PrimerBank: база данных праймеров ПЦР для количественного анализа экспрессии генов, обновление 2012 г.
Nucl. Acids Res. (2012) 40 (D1): D1144-9.
Athanasia Spandidos, Xiaowei Wang, Huajun Wang и Brian Seed: PrimerBank: ресурс пар праймеров для ПЦР человека и мыши для обнаружения и количественной оценки экспрессии генов
Nucleic Acids Research 2010 38: D792-9.
Athanasia Spandidos, Xiaowei Wang, Huajun Wang, Stefan Dragnev, Tara Thurber и Brian Seed: исчерпывающий набор экспериментально подтвержденных праймеров для количественного определения количества транскриптов мыши с помощью полимеразной цепной реакции.
BMC Genomics 2008, 9: 633
Xiaowei Wang и Brian Seed: банк праймеров для ПЦР для количественного анализа экспрессии генов.